第一部分运动神经元病的临床表现、诊断、治疗与转归背景：运动神经元病(motor neuron disease, MND)是一类病因未明的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干后组运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束的神经变性疾病,主要临床特征为上运动神经元(upper motor neuron, UMN)和下运动神经元(lower motor neuron, LMN)受损的症状和体征。MND主要分为四种类型：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、进行性肌萎缩(progressive muscular atrophy, PMA),进行性延髓麻痹(progressive bulbar palsy, PBP)以及原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis, PLS)。 MND的发生率与患病率因年龄、性别、种族和地域而不同,与遗传因素、职业特点、特殊物质接触史等存在一定的关联。在临床流行病学方面,近数十年以来进行了多项横断面研究,揭示了部分可能的危险因素。目前该病的发病机制仍不明确,生物化学、分子生物学与细胞生物学等基础医学领域的研究提出了不同的学说。MND缺乏有效的治疗方法,预后不良。通过各种手段及早明确诊断和适当的支持治疗具有重要的意义。目的：本研究主要针对MND患者的一般信息、发病情况、临床表现、个人史、既往史、家族史、诊断情况、治疗方法以及自然病程进行调查。通过整理所获的临床资料,对可能影响发病的因素、疾病的临床特点、诊治现状等进行分析。本研究的意义在于总结了MND患者的临床特点,为进一步探索MND的病因和发病机制提供线索,从而为疾病的预防与治疗增加可能性。方法：本研究调查对象主要为北京协和医院神经科门诊就诊的MND患者,开始于2009年9月1日,终止于2012年2月20日,对符合入选标准的病例使用统一的调查表,采用问卷式调查,收集患者信息。病例数据录入Microsoft Access数据库,数据库中设立性别、年龄、职业、发病时间、起病部位、家族成员患神经系统疾病史、既往患病情况、外伤史、有毒物质接触史、诊断分型、误诊情况、患者及家属的知情情况、药物治疗、其他治疗,以及对治疗手段的接受程度等项。对2009年9月至2011年8月间入组的患者进行每6个月一次的随访,记录患者的存活情况。使用SAS for Windows9.1软件进行数据统计工作。结果：共入组MND患者224例,包括ALS187例(83.5%)；PBP20例(8.9%)；PMA13例(5.8%)；PLS4例(1.8%)。其中男性144例(64.3%),女性80例(35.7%)男女之比1.80：1。发病年龄平均49.1±10.7岁,确诊时间平均12.1±10.2个月,189例(83.6%)就诊在3次以内确诊为MND。起病部位为延髓39例(17.4%),颈段120例(53.6%),胸段3例(1.3%),腰骶段52例(23.2%)。6.7%的患者有家族史。患者职业以农林牧渔劳动者(21.4%)、生产运输工作和部分体力劳动者(13.4%)以及专业技术人员(13.0%)居多。65例(29.0%)有吸烟史,60例(26.8%)有长期饮酒史,55例(24.6%)曾有有毒物质职业接触史。患者知情者105例(46.9%)；家属知情者211例(94.2%)。服用过利鲁唑的患者55例(24.6%),165例(73.7%)服用过各类维生素,118例(52.7%)服用过辅酶Q10片,中药治疗的患者21例(9.4%),康复治疗的患者18例(8.0%),针灸治疗的患者33例(14.7%),情绪和心理治疗的患者7例(3.1%)。有意向接受经皮内镜下胃造瘘术(percutaneous endoscopic gastrostomy, PEG)、鼻饲、无创正压通气(noninvasive positive pressure ventilation, NIPPV)、气管切开的患者分别为54例(24.1%),71例(31.7%),67例(29.9%)和43例(19.2%)。随访中PBP与PMA的死亡率分别为26.4%、43.8%和8.3%。结论：MND发病男性多于女性；年龄多在50-60岁；职业主要为农林牧渔劳动者；大多数患者为散发性,少数有家族史；部分患者曾有农药、重金属等物质接触史。起病部位以颈段最多。ALS最为常见,其次是PBP及PMA。患者知情率偏低,使用利鲁唑治疗的比例较低,使用维生素类药物和辅酶Q10治疗的比例较高,接受呼吸及营养支持治疗的患者不多,尤其接受有创性治疗方式的患者较少。MND的预后普遍较差。第二部分运动神经元病自主神经功能与皮肤交感反应的研究背景：运动神经元病(]notor neuron disease, MND)是一组病因未明的慢性进行性神经变性疾病,临床兼有上、下运动神经元及传导束受损体征,表现为肌无力、肌萎缩和／或锥体束征的不同组合。虽然传统观念认为MND是选择性侵犯运动神经系统的变性疾病,但近年来的研究证实一些运动神经元病患者可伴有多系统的损害。研究发现MND的自主神经功能障碍包括心血管系统、消化系统、腺体分泌等方面。在临床神经电生理检测方法中,皮肤交感反应(sympathetic skin response, SSR)以其无创性、操作简单、敏感且可靠的优势越来越多地应用于临床。目的：本研究的目的在于调查运动神经元病患者的自主神经系统损害情况,并对患者进行SSR检查,从而对运动神经元病的自主神经受损程度进行评估。方法：收集来自2009年11月至2011年8月就诊于我院神经科门诊的MND病例。记录患者有无自主神经系统受损表现,包括：皮肤麻木或瘙痒；出汗异常包括出出汗减少、冷汗或多汗；口干；唾液分泌过多或流涎；皮温异常；体位性低血压；体位相关性心律失常；瞳孔大小或对光反射异常；无明确原因的腹泻或便秘；排尿障碍；性功能障碍。对MND患者行SSR检查,测定结果参照北京协和医院肌电图室的正常标准,按不同年龄正常值标准进行对照。计算SSR异常率及电生理检查与临床表现之间的相关性。结果：共收集MND患者142例。患者中自主神经功能受损的出现率分别为：皮肤麻木76例(53.5%)；皮肤瘙痒22例(15.5%)；出汗异常15例(10.6%)；口干13例(9.1%)唾液分泌过多3例(2.1%)；皮温异常21例(14.8%)；体位性低血压3例(2.1%);体位相关性心律失常1例(0.7%)；无明确原因的腹泻6例(4.2%)；便秘23例(16.2%)；排尿障碍14例(9.9%)；性功能障碍2例(1.4%)。142例MND患者中,SSR正常91例(64.1%),异常51例(35.9%)。上肢SSR异常12例(8.5%),上肢潜伏期延长2例(1.4%),波幅降低8例(5.6%),波形消失4例(2.8%)；下肢SSR异常47例(33.1%),下肢潜伏期延长4例(8.5%),波幅降低31例(21.3%),波形消失15例(10.6%)；上下肢均异常为7例(4.9%),上下肢波形均消失3例(2.1%)。MND患者SSR与正常值比较,上肢潜伏期延长(P<0.05),上下肢波幅均显著降低(均P<0.01)。ALS的各El-Escorial诊断分型之间无显著差异,下肢起病组异常率最高,有统计学意义。各自主神经功能损害表现与上下肢SSR波幅、潜伏期之间无明显相关性。结论：MND可出现皮肤、腺体分泌、心血管系统、膀胱直肠括约肌等临床自主神经功能异常的表现。部分MND患者出现SSR的异常,表现为潜伏期延长和波幅降低。电生理改变与临床自主神经症状之间不具有相关性。下肢起病患者的SSR异常率较高。第三部分肌萎缩侧索硬化患者铜-锌超氧化物歧化酶蛋白表达与氧化修饰背景：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种发病机制尚不明确的神经系统变性疾病,是运动神经元病的常见类型。5%～10%的ALS患者具有家族遗传史,称为家族性ALS (familial amyotrophic lateral sclerosis, fALS);其余为散发性ALS (sporadic amyotrophic lateral sclerosis, sALS)。既往研究已经发现异常表达的铜-锌超氧化物歧化酶(Cu, Zn-superoxide dismutase, superoxide dismutase-1, SOD1)具有毒性作用,主要途径为蛋白氧化、错误折叠和聚集,导致运动神经元损伤。但除流行病学研究提示一些有毒物质与ALS发病相关,SOD1导致疾病的机制尚未完全阐明。有学说认为不仅基因突变所表达的SOD1具有针对运动神经元的毒性作用,野生型SOD1发生氧化和错误折叠,可获得与突变SOD1相同的属性,而氧化修饰是SOD1基因表达过程中翻译后修饰的重要步骤。在本课题相关的前期研究中,根据对家族性ALS的临床特点的观察和基因分析比较,我们发现SOD1基因突变并不与临床表型具有明显的一对一关系。具有相同突变基因的ALS患者间,突变蛋白对运动神经元产生的损伤不均一。结合之前文献关于SOD1蛋白在ALS发病中的毒性作用的分析,可提出假设,认为异常的氧化修饰可能导致SOD1蛋白的异常表达,从而导致ALS发病相关的一系列病理生理过程。目的：在以往研究的理论基础上进一步分析突变型SOD1蛋白的毒性与其氧化修饰水平之间的关系,以及野生型SOD1是否具有这一相同的致病途径。使用常规蛋白印迹法等方法探索突变或野生型SOD1的氧化修饰过程在ALS发病过程中的作用。设计比较家族性ALS患者、散发性ALS患者与正常人SOD1的氧化修饰属性是否具有不同,如果能进一步证实氧化修饰在ALS机制中的作用,将有可能为寻找疾病新的生物标记物提供线索,并为研究ALS的治疗方法提供参考。方法：我院神经科门诊和病房收集fALS患病家系成员及sALS病例,对每例散发性患者和ALS家系成员抽取外周静脉血,对照组选取年龄、性别与患者组一一匹配的人群静脉血标本。对ALS家系成员、散发性ALS患者和对照组进行SOD1基因检测。根据与黄嘌呤氧化酶作用测定ALS患者与正常对照组红细胞总SOD活性。使用Western印迹法分析ALS患者外周血单个核细胞与血清中SOD1的表达水平与聚集情况。分别使用碘乙酸孵育与β-巯基乙醇处理的外周血单个核细胞提取的蛋白样品,进行SOD1蛋白氧化-还原水平的检测。应用双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE),基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(matrix assisted laser desorptionionization-time offlight mass spectrometer, MALDI-TOF-MS)方法进行ALS患者与正常人混合血清的差异蛋白质组学分析,判断ALS患者中是否存在SOD1的异常氧化修饰形式。结果：共收集sALS185例和7个ALS患病家系成员的病例资料和外周血。根据测序和BLAST比对,在ALS患者中未发现明确SOD1基因突变。年龄匹配的ALS患者与正常对照组比较,红细胞SOD活性无显著差异(0.158U/ml vs0.150U/ml,P>0.05)。在不携带SOD1基因突变的ALS患者中,SOD1在血清或外周血单核细胞中的聚集程度无显著差异(均P>0.05)。无SOD1突变的sALS患者与年龄、性别均匹配的正常对照比较,氧化/还原型SOD1在外周血单核细胞中的聚集程度无显著差异(均P>0.05)。对2D-PAGE分离后得到的差异点进行质谱分析,发现其结构不符合SOD1多肽特征,未发现ALS患者血清中SOD1蛋白的异常氧化修饰。结论：不携带SOD1突变的ALS患者红细胞SOD活性正常,SOD1蛋白的分子量大小与表达量不发生显著改变,本研究也没有观察到异常的氧化还原状态。在不发生氧化应激的情况下,ALS患者中的野生型SOD1与正常SOD1蛋白之间多肽结构的差别。对于无SOD1突变的ALS患者,野生型SOD1的结构和基本性质没有显著改变,氧化修饰可能并非与ALS致病相关的首发机制。野生型SOD1是否具有与突变SOD1蛋白相似的属性及其对运动神经元的毒性机制仍有待进一步研究。