【摘 要】
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目的:细菌性痢疾在全世界范围内属于一种高发病率的急性肠道传染病,严重威胁人类身体健康,志贺氏菌是其主要致病菌。志贺氏菌致病的关键因素依赖于细菌III型分泌系统（T3SS）,志贺氏菌将T3SS分泌的毒力蛋白注入人体,从而引发细菌性痢疾。侵袭质粒抗原基因Ipa H家族是福氏志贺氏菌T3SS分泌的效应分子,目前对于其致病机理还未完全明确,本课题拟以家族成员中的Ipa H4.5作为研究对象,揭示Ipa H
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目的:细菌性痢疾在全世界范围内属于一种高发病率的急性肠道传染病,严重威胁人类身体健康,志贺氏菌是其主要致病菌。志贺氏菌致病的关键因素依赖于细菌III型分泌系统（T3SS）,志贺氏菌将T3SS分泌的毒力蛋白注入人体,从而引发细菌性痢疾。侵袭质粒抗原基因Ipa H家族是福氏志贺氏菌T3SS分泌的效应分子,目前对于其致病机理还未完全明确,本课题拟以家族成员中的Ipa H4.5作为研究对象,揭示Ipa H4.5作为志贺氏菌重要致病因子致病的分子机制,以期为新型抗细菌治疗药物的开发提供潜在靶点。方法:（1）利用序列比对的方法筛选出Ipa H4.5是否具有TBC GAP结构域,即谷氨酰胺指基序（glutamine-finger motif,Yx Q）和精氨酸指基序（arginine-finger motif,Ixx Dxx R）;通过体外水解实验,研究Ipa H4.5的GAP酶活性及其可能的靶标;通过同源重组试剂盒,构建Ipa H4.5 GAP酶突变体,研究其GAP酶活性的主要基序。（2）通过免疫共沉淀实验分析Ipa H4.5及其靶标的相互作用及相互作用的关键位点;激光共聚焦研究二者相互作用对甘露糖6-磷酸受体（MPR）运输的影响。（3）利用Magic Red-RR试剂盒研究Ipa H4.5 GAP活性对于MPR运输的溶酶体组织蛋白酶B活性（Cat B）的影响;通过蛋白免疫印记,检测Ipa H4.5及其突变体对溶酶体组织蛋白酶D（Cat D）成熟的影响;为进一步确定Ipa H4.5对溶酶体功能的影响是否由Rab31所介导,对Rab31或其突变体与Ipa H4.5共转染的Rab31敲低细胞中的Cat B活性进行分析。（4）构建Ipa H4.5缺失以及不同回复株,通过野生型志贺氏菌和突变型志贺氏菌感染实验,采用免疫荧光染色方法,来研究不同菌株对MPR运输的影响;通过免疫印迹手段,研究不同菌株对Cat D成熟的影响;通过Magic Red-RR试剂盒,研究不同菌株对对Cat B活性的影响;采用细菌定量实验,评估Ipa H4.5 GAP酶活性缺失对志贺氏菌胞内持久性的影响。通过以上方法,明确Ipa H4.5具有GAP酶水解活性,并建立该活性与志贺氏菌毒力之间的相关性。结果:第一部分:我们发现Ipa H4.5具有TBC GAP基序,以Ipa H4.5为研究对象,发现其具有GAP酶活性,能够靶向Rab31促进其GTP水解,主要活性位点在N端的R41和Q203位点。第二部分:Ipa H4.5与Rab31可以相互作用,相互作用依赖其GAP活性位点以及Rab31的GTPase活性位点;Rab31的定位受Ipa H4.5的影响,从核周富集到点状扩散分布,同时Ipa H4.5也破坏了MPR的从高尔基体到内体的运输过程。第三部分:Ipa H4.5抑制了Pro-Cat D的切割以及Cat B活性,以上表型均依赖于Ipa H4.5的GAP酶活性以及Rab31的GTPase活性。第四部分:和志贺氏菌野生型相比,Ipa H4.5缺失菌株以及志贺氏菌回复突变株感染后,被破坏的MPR分布和溶酶体活性均趋于正常,Ipa H4.5缺失菌株的胞内持久性明显下降。结论:综上所诉,志贺氏菌T3SS效应分子Ipa H4.5具有GAP酶活性,通过靶向Rab31抑制溶酶体降解,进而逃逸宿主对其清除。通过以上研究,以期为新型抗细菌治疗药物的开发提供潜在靶点。
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