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药物开发过程中,90%遭淘汰的侯选药物中有50%是因为毒性原因而遭淘汰。为保障人类健康,企业或机构需要评估新化合物的毒性,这种安全性评价通常是基于动物毒理实验。以体外方法替代体内方法可以在筛选化合物同时,预测化合物急性口服毒性,由此加速药物开发。体外毒性测试方法有快速、廉价、实验条件可控、结果易于定量等诸多优点。在制药工业中引进中、高通量体外筛选,可以大量减少动物实验和分析大量合成化合物的成本。因此,药物研发部门需要在开发早期以中、高通量体外检测方法(且只需相对微量的化合物就可检测毒性)检测化合物毒性,如细胞毒性测试或靶向毒性测试。目的本论文以原代分离培养的大鼠皮质神经元以及大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞为神经毒性细胞模型;原代大鼠心肌细胞和大鼠传代心肌细胞H9c2为心肌毒性细胞模型;人正常胎肝细胞L-O2细胞、人肝癌HepG2和BEL-7402细胞等三种人源性肝细胞株作为肝毒性细胞模型,用以评价药物或化合物对神经、心肌与肝脏的急性毒性,经过与动物体内急性毒性(LD50)等指标对比、分析确认体内外安全性评价体系的相关性,以及是否可以部分或者完全替代动物毒理实验,为建立稳定的体外高通量筛选化合物和药物的急性毒性评价体系奠定基础。方法(1)药物/化合物神经毒性实验:细胞的分离和培养原代分离24h内新生SD大鼠皮质神经元,培养在预先铺好多聚赖氨酸的96孔板,至7-10d细胞状态最佳时用于实验;传代PC12细胞以5×105密度种96孔板,37℃、5%CO2、100%湿度常规培养24h,用于实验。取17种药物和化合物(具一定神经毒性),分别与原代神经元和PC12细胞于CO2培养箱孵育24h,设立不同浓度组与空白对照组,观察细胞形态变化;以MTT法检测药物/化合物对细胞生长的抑制率,据此量效曲线计算出IC50,与大鼠口服LD50进行相关性分析。(2)药物/化合物心脏毒性实验原代分离24h内新生SD大鼠心肌细胞,培养在96孔板,4-7d细胞状态最佳时用于实验;传代H9c2细胞以1×105密度种96孔板,常规培养24h,用于实验。取20种药物和化合物(具一定心脏毒性)分别与原代大鼠心肌细胞和大鼠心肌细胞H9c2于CO2培养箱孵育24h,设立不同浓度组与空白对照组,观察细胞形态变化以及心肌搏动频率变化;以MTT法检测药物/化合物对细胞生长的抑制率,据此量效曲线计算出IC50,与大鼠口服LD50进行相关性分析。(3)药物/化合物肝脏毒性实验人肝癌细胞HepG2、人肝细胞癌BEL-7402细胞、人正常胎肝细胞LO-2细胞三种人源肝细胞株以1×105密度种96孔板,常规培养24h,用于实验。取21种药物和化合物(具一定肝毒性)分别与三种人源肝细胞(人肝癌细胞HepG2、人肝细胞癌BEL-7402细胞、人正常胎肝细胞L-O2细胞)于CO2培养箱孵育24h,设立不同浓度组与空白对照组,观察细胞形态变化;以MTT法检测药物/化合物对细胞生长的抑制率,据此量效曲线计算出IC50,与大鼠口服LD50进行相关性分析。结果(1)原代大鼠皮质神经元的IC50与动物体内LD50相关性为:R2= 0.77,PC12细胞毒性检测结果的IC50与动物体内急性毒性LD50相关性为: R2=0.64,有明显相关性。以17种化合物每次实验所得IC50值的平均值与已知的大鼠口服LD50(来源于化学品安全数据库)进行回归得到了回归公式:lg(LD50)(mg/kg)=0.4575 lg(IC50)(mg/ml)+3.2826(大鼠皮质神经元),lg(LD50)(mg/kg)=0.4715lg(IC50)(mg/ml)+3.1721(PC12)。在此公式中代入实验得到的IC50值可以预测大鼠口服LD50值。(2)原代大鼠心肌细胞的IC50与体内LD50相关性为:R2= 0.76,大鼠心肌细胞H9c2细胞毒性检测结果的IC50与动物体内急性毒性LD50相关性为:R2=0.67,有明显相关性;以20种化合物每次实验所得IC50值的平均值与已知的大鼠口服LD50(来源于化学品安全数据库)进行回归得到了回归公式:lg(LD50)(mg/kg)=0.5177lg(IC50)(mg/ml)+ 3.1602(大鼠心肌细胞),lg(LD50)(mg/kg)=0.4362lg(IC50)(mg/ml)+ 3.2283(H9c2)。在此公式中代入实验得到的IC50值可以预测大鼠口服LD50值。随药物或化合物浓度升高,细胞形态改变,心肌搏动异常乃至停搏。(3)体外HepG-2的IC50与体内LD50相关性为:R2= 0.81, L-O2细胞毒性检测结果的IC50与动物体内急性毒性LD50相关性为:R2=0.81,BEL-7402细胞毒性检测结果的IC50与动物体内急性毒性LD50相关性为:R2=0.60,有明显相关性。以21种化合物每次实验所得IC50值的平均值与已知的大鼠口服LD50(来源于化学品安全数据库)进行回归得到了回归公式:lg(LD50)(mg/kg)=0.569 lg(IC50)(mg/ml)+ 3.3062(HepG2),lg(LD50)(mg/kg)=0.5332lg(IC50)(mg/ml)+ 3.2913(L-O2);lg(LD50)(mg/kg)=0.5462lg(IC50)(mg/ml)+ 3.1746(BEL-7402)。在此公式中代入实验得到的IC50值可以预测大鼠口服LD50值。结论利用体外分离培养的原代神经元、心肌细胞以及正常肝脏细胞可以在体外评价受试化合物、药物的急性毒性,与动物体内急性毒性LD50所得结果进行比较,两者存在着较好的相关性,其中以原代培养细胞的相关性较高;传代细胞如PC12、HepG2、BEL-7402等细胞,培养条件相对较低,技术要求不高,也可以在短时间(24h)内评价药物或化合物的急性毒性,与动物体内LD50数据比较也存在着相关性。上述实验结果表明,建立体外细胞安全性评价模型和体系可以预测化合物对人及动物的毒性,基本可以部分替代或减少动物实验,在短时间内对大规模化合物、药物的急性毒性进行评价方面具有显著优势,具有省时、省力、节约经费、重复性等优点;而选用不同组织来源的细胞系代表相应靶器官、系统,可以进行系统及器官选择性毒理安全性评价。我们通过建立原代、传代细胞培养平台,为快速、高通量筛选药物或化合物毒性、部分取代或者减少动物实验奠定试验基础。