Pseudidiomarina homiensis ZJCN121岩藻多糖酶生产、固定化和酶学性质研究

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本文对我国浙江苍南海域采集的样品(包括海水,海泥,礁石,海藻,腐木,海贝),采用平板稀释法分离海洋细菌,共分离得到细菌66株。以岩藻多糖为唯一碳源,经过初筛和复筛得到5株产岩藻多糖酶细菌,占所筛细菌总数的7.58%;从腐木中分离出产岩藻多糖酶细菌所占比例最高,为25%。其中菌株ZJCN121的岩藻多糖酶产量最高,酶活力为0.71IU/mL,且发酵性能较稳定,被确定为下一步研究对象。   本文考察了菌株ZJCN121形态特征和生理生化特征,并测定了其16SrDNA序列,与GeneBank获取的序列比对,其与PseudidiomarinahomiensisPO-M2同源性达98%。由于菌株ZJCN121的形态特征和生理生化特征与PseudidiomarinahomiensisPO-M2的部分不同,因此认为菌株ZJCN121是霍米海角假海源菌(Pseudidiomarinahomiensis)的变种。   为了提高岩藻多糖酶产量,对细菌ZJCN121培养基组分和发酵条件进行优化。首先通过单因素试验确定了最佳碳源为复合碳源(麸皮+葡萄糖),最佳氮源为NH4NO3,岩藻多糖浓度为0.59g/L;其次通过Plackett-Burman法在8个因素中确定出对产岩藻多糖酶的主要影响因素为麸皮、NaCI和岩藻多糖,利用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,最后设计Box-Behnken中心组合试验确定出培养基最佳组分:麸皮2.7g/L,NaCI31.25g/L,岩藻多糖0.59g/L。同时对细菌ZJCN121发酵条件也进行了优化,实验结果表明:当起始pH为6.5,接种量为2%,装液量为100mL/250mL时,在20℃培养24h,岩藻多糖酶活力达到最高,为1.19IU/mL。   采用壳聚糖、凹凸棒石和D101-I树脂三种固定化材料对岩藻多糖酶进行固定化,实验结果表明壳聚糖的固定效果好于其它二种载体;研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对岩藻多糖酶的最佳固定化条件,将1g壳聚糖载体加入到浓度为1.5%戊二醛中交联2h后,给酶量为22IU,在吸附固定化温度为40℃,转数为40r/min条件下,吸附固定4h后,固定化酶酶活力为2.43IU/g。对固定化酶和游离酶酶学性质也进行了研究,实验结果表明固定化酶最适反应温度为55℃,游离酶为50℃;固定化酶半失活温度为69℃,游离酶为62℃;固定化酶最适反应pH为7.0,游离酶为6.5;固定化酶和游离酶在pH为6.0-7.0的范围内较稳定;Fe2+、Cu2+和Mn2+对岩藻多糖酶活力有抑制作用,Ca2+对酶活力有促进作用;固定化酶Km值为7.48mg/mL,Vmax为3.19g/(L·min),游离酶Km值为5.44mg/mL,Vmax为5.94g/(L·min)。
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