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目的:梗阻性黄疸(Obstructive Jaundice,OJ)是由肝内外胆管狭窄或闭塞所致的一组常见疾病。胆管梗阻后,由于胆汁及其诸多成分不能流入肠内,将导致胆管内压升高、肝血流改变以及一系列生化等方面的改变和多脏器的病理改变。易导致感染和肝、肾等器官功能衰竭,术后并发症和病死率较高。目前尚无理想的防治方法。探寻减轻梗阻性黄疸病人肝、肾、肠等脏器损害的方法,对降低病人围手术期并发症及死亡率有重要意义。
方法:
1动物模型制备
实验动物术前12h禁食,自由饮水。用10％水合氯醛(0.3g/kg)腹腔注射麻醉,取上腹部正中切口入腹,显露第一肝门,钝性游离并用0号丝线双重结扎胆总管,造成肝内外胆管完全梗阻,分2层缝合腹壁。假手术组仅进行腹腔游离,不结扎胆总管。
2动物分组
Wistar大鼠30只,雄性,体重230g～260g,随机分三组,假手术组(sham operation,SH组)(n=10):开腹后游离胆总管但不结扎;梗阻性黄疸组(obstructive jaundice,OJ组)(n=10):开腹后双重结扎胆总管,造成肝内外胆管完全梗阻;前列腺素E1治疗组(OJ+PG E1组)(n=10):动物模型同OJ组,手术1周后PG E1治疗组大鼠予以前列腺素E10.1微克/kg·d)腹腔内注射,SH组和OJ组大鼠予以相同剂量生理盐水,连续注射14d。手术后第21天处死动物,采血样4000r/min,5min离心分离血浆,置-20℃冰箱内保存备用。切取肝脏、肾脏及末端回肠组织制作标本,用于各种指标的检测。
3检测指标
3.1肝功能和肾功能的检测
血清总胆红素、直接胆红素、谷丙转氨酶(ALT)、胆汁酸、肌苷(Cr)、尿素氮(BUN)采用全自动生化分析仪测定。
3.2血浆内毒素、D-乳酸、TNF-α、IL-6测定:血浆内毒素采用偶氮显色法,血浆D-乳酸采用改良分光光度法测定,血浆TNF-α、IL-6采用放射免疫法测定。
3.3肝、肾、末段回肠黏膜活化NF-κB、Bcl-2、Bax、VCAM-1、ICAM-1(肝组织细胞间黏附分子-1)的表达:免疫荧光标记检测NF-κB p65的表达;采用链酶亲和素法检测Bcl-2和Bax表达;采用PE标记的VCAM-1、ICAM-1单克隆抗体检测VCAM-1、ICAM-1表达。
3.4 TUNEL法检测肝细胞、肾小管上皮、肠黏膜细胞凋亡:采用凋亡检测试剂盒,按试剂盒操作说明对石蜡切片进行染色,在光镜下观察5个高倍视野中阳性细胞百分数,以此作为凋亡指数。
3.5组织形态学检查
肝、肾、末段回肠组织固定于中性甲醛溶液中,常规脱水,石蜡包埋,切片HE染色后光镜下观察。测量切片肠黏膜厚度、肠黏膜的绒毛高度各10次,取其均数。
3.6数据处理
采用SPSS10.0统计学软件包,采用t检验、卡方检验等对各表达与临床病理资料进行相关性分析,实验数据以均数±标准差(x-±S)表示。P＜0.05为有统计学意义,p＜0.01为有统计学显著意义。
结果:
1术后生化指标变化
直接胆红素、谷丙转氨酶(ALT)、胆汁酸、肌苷(Cr)、尿素氮(BUN)水平在梗阻性黄疸各组都明显高于假手术组;OJ+PGE1组的血清各指标水平均明显低于OJ组。
2术后血浆内毒素、D-乳酸、TNF-α、IL-6测定水平在梗阻性黄疸各组都明显高于假手术组;OJ+PGE1组的各指标水平均明显低于OJ组。
3肝、肾、末段回肠黏膜活化NF-κB p65、Bcl-2、Bax、VCAM-1、ICAM-1(肝组织细胞间黏附分子-1)的表达:在SH组各因子表达处于未见表达或仅见少量表达。OJ组各因子均表达强烈。而OJ+PG组各因子亦有明显表达,但相较于OJ组则有明显表达减少。
4肝细胞、肾小管上皮、肠黏膜细胞凋亡指数
在SH组凋亡指数约等于零。OJ组凋亡现象明显,可观察到大量着色的凋亡细胞,凋亡指数高。而OJ+PG组可见凋亡现象,但凋亡指数较OJ组有明显减少,有统计学差异。
5假手术组肠绒毛结构正常。梗阻性黄疸模型组肠绒毛结构不均匀、增宽水肿,黏膜萎缩,绒毛高度下降,大量炎细胞浸润。OJ+PGE1组肠绒毛结排列相对整齐,仅绒毛间质水肿减轻,充血减少,绒毛高度较模型组升高,炎细胞浸润减少。模型组大鼠回肠末端黏膜厚度及绒毛高度值均显著低于假手术组(p＜0.01),而OJ+PGE1组显著高于模型组(p＜0.05)。
结论:本实验结果说明前列腺素E1对梗阻性黄疸大鼠肝脏损害有保护作用;对梗阻性黄疸大鼠肾脏损害的有保护作用;同样对梗阻性黄疸大鼠肠粘膜损害有保护作用。此外,NF-κB信号通路在梗阻性黄疸大鼠肝、肾、肠粘膜损害中起重要作用。它在梗阻性黄疸时机体所发生的炎症反应中起到了重要的作用。