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膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤,临床上90%以上的膀胱癌为膀胱尿路上皮癌。膀胱癌的发生发展是一种多因素参与的复杂的病理生理过程,受遗传因素和外部环境因素共同影响。由于膀胱癌患者术后存在较高的复发风险,因此,对膀胱癌分子机制的研究以及发现新的治疗靶点显得尤为重要。m6A甲基化修饰是真核细胞在mRNA和非编码RNA水平最常见的一种修饰方式。m6A甲基化修饰是由酶催化的可逆反应,这些酶包括甲基化酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。m6A甲基化修饰调节异常与多种恶性肿瘤的进展密切相关。FTO蛋白是常见的m6A去甲基化酶,研究表明FTO可通过调控miRNA的合成影响肿瘤的进展。miRNA是一类内源性非编码RNA,经碱基互补配对与其靶mRNA的3’端非编码区（3’-UTR）相结合,形成RNA诱导沉默复合体,诱导靶mRNA发生降解或者抑制其翻译成蛋白质。miR-576在调控细胞增殖、侵袭和凋亡等过程中发挥重要的生物学作用,并与多种恶性肿瘤的发生和进展密切相关。研究证实,m6A甲基化修饰可促进DGCR8蛋白更高效地识别并结合初级miRNA（pri-miRNA）,从而提高成熟miRNA的表达水平。细胞周期蛋白依赖性激酶-6（CDK6）是CDKs家族的重要成员,可加速细胞周期通过G1/S期检查点,催化细胞周期由G1期进入S期。CDK6还可提高DNA的自我修复能力并促进细胞分裂与增殖。因此,CDK6的异常激活可导致细胞周期紊乱,使细胞发生不可控制的增殖,导致恶性肿瘤的发生。基于上述背景,本课题首先研究FTO在膀胱尿路上皮癌组织中的表达情况及与临床指标的关系,以及FTO的表达水平对膀胱尿路上皮癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期和成瘤能力的影响;然后,通过确定分子信号通路,验证FTO通过m6A途径调控膀胱尿路上皮癌细胞增殖等恶性行为。通过本项研究,验证FTO在膀胱尿路上皮癌中的作用以及分子信号通路,可更好地预测患者预后以及指导靶向药物的选择。第一部分FTO在膀胱尿路上皮癌组织中的表达情况及作用本部分研究目的:1.明确FTO在膀胱尿路上皮癌中的表达情况;2.研究FTO表达水平与相关临床指标的关系;3.探究FTO对膀胱尿路上皮癌细胞增殖、侵袭、迁移、周期以及成瘤能力等生物效应的影响作用。具体结果如下:1.FTO在膀胱尿路上皮癌组织中表达增高通过RT-qPCR及Western blot法检测FTO在癌组织及癌旁组织中的表达情况。结果显示,FTO在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。2.FTO表达水平与膀胱尿路上皮癌患者T分期及预后密切相关分析膀胱肿瘤组织芯片（TMA）发现,FTO表达水平与T分期呈正相关性（P=0.035）;FTO表达水平与患者年龄、性别以及病理分级无明显相关性（P＞0.05）;通过Gepia数据库以及对膀胱尿路上皮癌组织芯片中患者的生存信息进行分析发现,FTO高表达的患者预后较差。3.FTO表达水平可影响膀胱尿路上皮癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤能力,并可调控细胞周期CCK-8实验表明,FTO过表达可促进细胞增殖,FTO低表达则抑制细胞增殖;Transwell迁移和侵袭实验结果提示,FTO过表达可提高细胞迁移和侵袭能力,FTO低表达降低细胞迁移和侵袭能力;FTO过表达可促进细胞周期由G0/G1期进入S期,FTO低表达可诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。裸鼠成瘤实验结果显示,FTO过表达可促进小鼠瘤体的生长,FTO低表达抑制小鼠瘤体生长。通过上述实验,证实FTO可增强膀胱尿路上皮癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤能力,并可调控细胞周期。第二部分FTO通过m6A途径调控膀胱尿路上皮癌细胞增殖等行为本部分研究目的:1、探究FTO调控miR-576合成过程的机制;2、验证miR-576可部分拯救FTO对细胞增殖速率和克隆形成能力的影响;3、验证FTO通过FTO/miR-576/CDK6轴调控CDK6的表达;4、探究CDK6与FTO在膀胱尿路上皮癌组织中表达水平的关系。具体结果如下:1.FTO通过m6A途径调控miR-576的合成通过LinkedOmics数据库预测膀胱尿路上皮癌中与FTO表达水平负相关的miRNA;经RT-qPCR验证,miR-576与FTO表达水平呈负相关性;RIP实验证实FTO通过与DGCR8蛋白结合,通过m6A途径调控miR-576的生成过程。2.miR-576可部分拯救FTO对膀胱尿路上皮癌细胞增殖速率和克隆形成能力的影响通过拯救实验,研究miR-576是否可作为FTO下游靶点调控膀胱尿路上皮癌细胞一系列生物学行为。CCK-8和克隆形成实验表明,miR-576可部分拯救FTO对膀胱尿路上皮癌细胞增殖速率和克隆形成能力的影响。3.FTO 通过 FTO/miR-576/CDK6 轴调控 CDK6 的表达通过miRNA数据库分析预测miR-576的靶基因,发现CDK6 mRNA的3’端UTR存在与miR-576的结合位点;随后进行双荧光素酶报告实验进一步证实CDK6为miR-576的靶基因。RT-qPCR以及Western blot实验结果提示FTO可调控CDK6的表达。通过蛋白水平的拯救实验证实miR-576可部分拯救FTO对CDK6表达水平的影响。4.CDK6在膀胱尿路上皮癌组织中的表达水平与FTO呈正相关通过RT-qPCR分析CDK6在癌组织及癌旁组织中的表达情况,结果提示CDK6在癌组织中表达水平较癌旁组织显著提高（P＜0.001）;相关性分析结果显示,CDK6与miR-576表达水平呈负相关,与FTO表达水平呈正相关。裸鼠成瘤组织中CDK6、ki-67与FTO表达水平呈正相关。本项研究证实FTO在膀胱尿路上皮癌组织中表达水平增高,并与患者的不良预后密切相关;FTO通过与DGCR8蛋白结合,调节primiR-576的剪切过程,影响成熟miR-576的表达水平,进而调控CDK6的表达,通过FTO/miR-576/CDK6轴促进膀胱尿路上皮癌细胞增殖、迁移和侵袭等行为;FTO在膀胱尿路上皮癌的进展中发挥重要作用,可作为判断患者预后的参考指标以及潜在治疗靶点。