研究背景:子痫前期（preeclampsia,PE）是一种由遗传、免疫、生活方式等多种因素、多种机制及多条通路导致的妊娠期高血压疾病。至今其病因和发病机制仍未完全阐明。它严重威胁母婴健康,目前在国际上,有关发病率的统计有细微差异,大概在3%-5%。它一直是孕产妇死亡的主要原因之一,也是围产儿发病和死亡的主要原因之一。子痫前期是妊娠期高血压疾病（HDP）的一种,子痫前期-子痫是HDP中一个独特的存在,它属于妊娠期特发性疾病,近年来,关于子痫前期的临床和基础研究均不断深入,相关的指南也不断更新。传统意义上讲,子痫前期的定义为妊娠20周后新出现的高血压合并蛋白尿。新的定义中还包括母体器官功能障碍,如肾功能不全、肝脏受累、神经或血液系统并发症、子宫胎盘功能障碍以及胎儿生长受限。目前对该病的病因和发病机制的理解是基于PE理论的两阶段学说。第一阶段是临床前期:胚胎形成早期,子宫内膜和浅肌层（交界区）准备不足,滋养细胞缺血缺氧,滋养细胞侵袭肌层功能受损,螺旋动脉适应不良,局部缺血-再灌注损伤,胎盘氧化应激和内质网应激,释放多种细胞因子（TNF-α、IL-2等）、抗血管生成因子（酪氨酸激酶-1、可溶性内皮素等）或alarmins（尿酸、无细胞胎儿DNA等）释放到母体血液循环系统,引发母体全身系统性炎症反应过度激活,引发广泛的血管内皮损伤,激活白细胞、补体和凝血,血栓形成和肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活,母体血容量减少,血管反应增强,最终导致子痫前期-子痫多样化的临床表现,进入第二阶段临床表现期（血压升高、水肿、低蛋白血症、尿蛋白增加、肺水肿等）。子痫前期是一种动态性疾病,可呈持续性进展。在缺乏有效治疗手段的情况下,子痫前期的治疗主要是稳定母亲和胎儿的状况后选择最佳的时机终止妊娠。而这也势必会带来一个不可避免的后果—早产及早产相关并发症,尤其是早发型子痫前期,对胎儿的影响更为严重。简单的预防措施,如饮食和生活方式的干预、补钙及服用阿司匹林等,虽对部分孕产妇来说是获益的,但并不能阻止部分孕产妇发展为重度子痫前期。目前对子痫前期的预测方面的研究很多,但都没有得到有效验证,也无法普遍应用于临床,子痫前期的发病率并没有下降趋势。因此,开发新的干预靶点和治疗策略仍然是我们临床需要解决的热点和难点问题。应激颗粒（Stress granules,SGs）是一种在真核细胞胞浆中形成的致密颗粒状物质,主要由多种蛋白质和核酸组成。在外界环境刺激下,SGs与信使核糖核蛋白（messenger ribonucleoprotein,mRNP）的重塑密切相关。在外界环境刺激下,真核细胞的蛋白质翻译被中止,还未翻译的mRNA与一些具有mRNA结合能力的蛋白聚集在一起,在胞浆中形成SGs。SGs是在翻译起始受抑制时形成,因此这些颗粒中招募了停止翻译的mRNAs。SGs的成分主要由含有48S起始复合物的聚（A）+mRNAs、小核糖体亚单位、mRNA衰减因子三四脯氨酸、翻译起始因子如真核翻译起始因子4E（eIF4E）、eIF4G、eIF4A和eIF4B,以及许多调节mRNA结构和功能的RNA结合蛋白组成,包括HuR,Staufen、Smaug、TTP、脆性X智力低下蛋白、G3BP、CPEB和SMN。SGs还包含某些支架蛋白,如Fas激活的丝氨酸/苏氨酸磷蛋白。SGs的聚集是一种可变的、动态的过程,它的形成依赖于颗粒内mRNPs的类型。由于外界刺激条件的不同,导致组成SGs的蛋白成分也不同。SGs的组装被认为是细胞对各种应激刺激如缺血、缺氧、氧化应激、热休克或病毒感染的一种保护机制。当外界环境刺激时,蛋白质翻译的过程被中止。mRNAs是从核糖体释放出来的,携带着特定RNA结合蛋白的包膜进入SGs。一旦外界刺激解除,某mRNAs离开SGs结构,然后被运送到细胞质进行蛋白质翻译,或运送到加工体（PBs）进行RNA降解。SGs是高度保守的RNP胞浆颗粒,在翻译调节、炎症反应、免疫反应、细胞凋亡、病毒感染和蛋白质错误折叠引起的细胞损伤等细胞活动中起着重要作用。炎症反应过度激活是公认的与子痫前期相关的因素。SGs在调节炎症和免疫反应中起着重要作用。然而,SGs是否参与PE的发病机制尚不清楚,目前也鲜见相关报道。本研究我们利用组织标本（晚孕胎盘,包括PE组和NC组）,通过定量PCR、蛋白印迹实验和免疫荧光等技术检测SGs的形成与定位情况,初步证实了 SGs标志性组分在子痫前期中的高表达,发现子痫前期患者胎盘组织中SGs有明显的聚集形成现象。我们还发现子痫前期患者的血清可诱导人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SvneoSGs的聚集形成。我们通过CoCl2（一种缺氧诱导剂）刺激人绒毛外滋养细胞系HTR-8/Svneo的缺氧模型,研究缺氧条件下SGs的形成情况,并进一步通过敲减SGs形成相关通路激酶蛋白的表达,检测缺氧条件下SGs形成的变化情况,以期探索SGs在重度子痫前期中的发生及其形成的分子机制,为今后的临床工作中子痫前期的早期诊断、病情监测、预后随访等提供理论依据。第一章 子痫前期胎盘组织中应激颗粒聚集形成的研究研究目的:对子痫前期发病机制的研究很多,炎症免疫反应过度激活在子痫前期的发病中具有重要的作用。SGs在翻译调节、炎症反应、细胞凋亡、病毒感染和蛋白质错误折叠引起的细胞损伤等细胞活动中起着重要作用。SGs及其形成的相关蛋白与炎症免疫反应密切相关,在调节炎症和免疫反应中发挥作用。而SGs是否参与了子痫前期的发生发展至今未见相关报道。在这里,我们收集子痫前期临床样本,通过相关实验来检测子痫前期胎盘组织中是否存在SGs的异常表达。研究方法:1.收集重度子痫前期患者和匹配妊娠孕产妇的临床信息,分成子痫前期组（PE组）和正常对照组（NC组）。PE组进一步分为eo-PE组（早发型子痫前期组）和lo-PE组（晚发型子痫前期组）。利用SPSS软件对PE组和NC组相关临床数据进行统计分析。2.应用苏木精和伊红（HE）染色技术,观察PE组及NC组胎盘组织显微镜下的病理特征。3.应用实时定量PCR技术检测PE组及NC组胎盘组织中SGs相关基因mRNA表达的差异性。4.应用western-blot技术检测PE组及NC组胎盘组织中SGs标志性蛋白HuR和G3BP表达的差异性。5.应用免疫荧光染色技术检测PE组及NC组胎盘组织中SGs的聚集形成情况。6.应用免疫荧光染色技术检测PE组及NC组血清处理HTR-8/Svneo细胞后,SGs的聚集形成情况。研究结果:1.SPSS软件分析发现:PE组和NC组在年龄、身高、血红蛋白方面无差异,在体重指数、收缩压、舒张压、平均动脉压、血小板、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿酸、乳酸脱氢酶、新生儿出生体重和新生儿Apgar评分方面均有显著差异性。进一步分组进行比较,发现eo-PE组和lo-PE组之间在体重指数、血小板、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿酸和乳酸脱氢酶方面并没有显著性差异。2.我们通过HE染色分析胎盘组织的病理特征。发现子痫前期患者胎盘组织非特异性的病理特征,可见绒毛缺血性梗死,绒毛间质血管扩张充血,绒毛周围纤维蛋白沉积。3.我们通过实时荧光定量PCR技术,发现PE组胎盘组织中SGs相关基因elavl1、lsm2、lsm4、ago1mRNA的表达较NC组显著升高。进一步分组进行比较发现eo-PE组和lo-EP组之间,elavl1、lsm2、lsm4和ago1的mRNA表达无显著性差异。4.我们通过western blot检测了两个经典的SGs标志性蛋白HuR和G3BP。结果显示,与NC组相比,PE组胎盘组织中HuR和G3BP蛋白的表达显著增加。进一步分组进行western-blot检测比较发现,与实时荧光定量PCR结果相似,eo-PE组与lo-PE组之间比较,胎盘组织中HuR表达的差异性没有统计学意义。5.我们通过免疫荧光实验,将HuR和G3BP作为SGs的标记蛋白进行染色。结果在PE组的胎盘组织中可见明显的HuR绿色标记荧光颗粒及G3BP红色标记荧光颗粒,而对照组几乎见不到标记性荧光颗粒。6.我们将HTR-8/Svneo细胞暴露于10%子痫前期患者血清或匹配妊娠妇女的血清的培养基中24小时,通过免疫荧光染色技术,发现子痫前期患者血清可诱导HTR-8/Svneo细胞HuR或G3BP阳性SGs的聚集形成现象。研究小结:在子痫前期患者胎盘组织中有HuR/G3BP 阳性的SGs的聚集形成,子痫前期患者血清可诱导人绒毛滋养细胞HTR-8/Svneo中HuR/G3BP 阳性的SGs聚集。提示SGs可能参与了子痫前期的发病过程。第二章缺氧诱导的HTR-8/Svneo细胞应激颗粒聚集形成的研究研究目的:在许多外界刺激时,如:丙二酸钠、亚砷酸钠、45℃热休克、冷休克和病毒感染等,细胞会产生应激反应,形成SGs。CoCl2是一种缺氧诱导剂,可被用于在体外诱导细胞缺氧环境,在细胞增殖、分化及应激反应中的研究比较常用。子痫前期发病的两阶段学说是以缺氧和浅层滋养细胞供血不足导致滋养细胞损伤为前提,子宫螺旋动脉重铸障碍,导致胎盘浅着床,胎盘持续缺血缺氧,发生持续的氧化应激及炎症反应,最终导致临床发病。在这里,我们通过CoCl2在体外构建缺氧模型,检测在缺氧条件下,HTR-8/Svneo细胞中是否存在SGs的聚集形成。研究方法:1.应用CoCl:构建滋养细胞缺氧模型:采用CCK-8细胞增殖实验检测滋养细胞在CoCl2刺激0h、24h和48h后的细胞增殖情况;采用细胞划痕实验,检测滋养细胞在CoCl2刺激0h、24h及48h后的细胞迁移情况;蛋白印迹实验检测滋养细胞在CoCl2刺激后HIF1α的蛋白表达情况。2.通过实时定量PCR技术检测滋养细胞在CoCl2刺激24h后,SGs相关基因mRNA的表达情况。3.应用western-blot技术检测滋养细胞在CoCl2刺激24h后,SGs相关蛋白HuR及相关通路P-EIF2 α与4EBP1的表达情况。4.应用免疫荧光染色技术检测滋养细胞在CoCl2刺激24h后SGs的聚集情况。研究结果:1.CoCl2处理后,滋养细胞的增殖能力和迁移能力均明显受到抑制,且HIF1 α蛋白水平显著升高。2.CoCl2处理后,滋养细胞 SGs 相关基因 Elavl1、Ago1、Lsm2、Lsm4、Dcp1a、Ddx6及Fubp1mRNA的表达水平显著升高。3.CoCl2处理后,滋养细胞SGs标志性蛋白HuR与相关通路蛋白P-eIF2 α表达水平显著升高,P-4EBP1显著下降。4.CoCl2处理后,免疫荧光染色拍照法观察到滋养细胞中HuR/G3BP阳性的SGs结构,对照组几乎观测不到。研究小结:CoCl2构建的HTR-8/Svneo细胞缺氧模型,可明显抑制HTR-8/Svneo细胞的增殖与迁移,能够诱导HTR-8/Svneo细胞中HuR和G3BP 阳性SGs的聚集形成。提示SGs可能在子痫前期的发生发展过程中扮演重要角色。第三章缺氧诱导的HTR-8/Svneo细胞应激颗粒形成的分子机制研究研究目的:根据前述的研究结果,我们发现,在子痫前期的发病过程中存在着SGs的聚集形成现象,子痫前期患者血清可诱导HTR-8/Svneo细胞SGs的聚集形成现象。通过使用缺氧诱导剂CoCl2,我们成功构建HTR-8/Svneo细胞缺氧模型,并通过实时定量PCR技术、western-blot技术和免疫荧光染色技术,成功在CoCl2诱导缺氧状态下的HTR-8/Svneo细胞胞浆中检测到了 SGs的聚集形成现象。eIF2 α磷酸化途径和4EBP1磷酸化途径是参与SGs形成的两条经典通路。在这里,我们通过小RNA干扰技术对SGs在HTR-8/Svneo滋养细胞中的形成通路进行探讨,以期明确子痫前期中SGs形成的相关分子机制。研究方法:1.通过RNA干扰技术分别敲低eIF2 α通路中的四个激酶（HRI、PKR、PERK和GCN2）和4EBP1,应用实时定量荧光PCR技术检测基因沉默的效果。2.通过RNA干扰技术分别敲低eIF2 α通路中的四个激酶（HRI、PKR、PERK和GCN2）和4EBP1,CoCl2处理后,应用western-blot技术检测P-eIF2 α和4EBP1表达的变化情况。3.应用RNA干扰技术和免疫荧光染色技术检测CoCl2处理后,不同干扰途径下SGs的形成变化情况。研究结果:1.通过小RNA干扰技术分别敲低eIF2 α磷酸化途径中的4个激酶以及4EBP1,应用实时定量PCR技术检测基因敲减后的沉默效果。我们发现基因敲减后HTR-8/Svneo细胞中四个激酶的表达均被抑制;4EBP1的表达也下调。2.通过RNA干扰技术分别敲低影响SGs形成的四个激酶,然后将CoCl2诱导缺氧状态下的HTR-8/Svneo细胞培养24小时,发现HRI siRNA能够显著削弱CoCl2诱导的eIF2 α磷酸化,并且抑制CoCl2诱导的SGs形成。3.我们通过RNA干扰技术敲低4EBP1,然后将CoCl2诱导缺氧状态下的HTR-8/Svneo细胞培养24小时,发现4EBP1 siRNA也能够显著抑制CoCl2诱导的SGs形成。研究小结:RNA干扰HRI通路后削弱了CoCl2诱导的eIF2 α磷酸化,干扰其他3条激酶通路没有影响;RNA干扰4EBP1后,降低了4EBP1的表达,减少了CoCl2诱导的SGs的形成。HRI介导的eIF2 α磷酸化途径和4EBP1途径都参与了CoCl2诱导的绒毛滋养细胞SGs形成过程。提示应激颗粒有可能成为未来子痫前期早期诊断、病情监测和预后随访的有效监测指标研究结论:1、子痫前期胎盘组织中存在SGs聚集形成,应激颗粒可能参与了子痫前期的发病。2、缺氧（CoC12）能够诱导HTR-8/Svneo细胞SGs聚集形成,提示应激颗粒的形成可能与子痫前期的病情程度有关。3、HRI激酶介导的eIF2 α磷酸化途径和4EBP1途径都参与了HTR-8/Svneo细胞中缺氧（CoC12）诱导的SGs形成。提示子痫前期中SGs的形成可能是通过4EBP1途径和HRI通路的eIF2 α磷酸化途径实现的。应激颗粒有可能成为未来子痫前期早期诊断、病情监测和预后随访的有效监测指标。