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研究背景由心肌梗死(Myocardial Infarction, MI)引起的缺血性心脏病(IschemicHeart Disease, IHD)是导致心力衰竭(Heart Failure, HF)的主要病因之一。尽管调脂、抗血小板等治疗可以减少动脉粥样硬化和冠心病的风险，以及早期介入治疗可以使MI病人的死亡率显著下降，但是MI后心肌细胞、心肌组织坏死和心功能降低，终末期时心室发生重构，心功能显著降低，心血管事件增多。心脏移植虽然是一种有效的治疗方法，但因为供体的数量有限，不能满足临床需要。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells, BMMSCs)移植治疗MI后的HF已经得到了初步的临床试验结果，诱导其分化形成为心肌样细胞的方法目前有很多，但获得的心肌样细胞在的生理学特性研究尚未完全明确，不同的诱导方法是否对细胞功能产生不同的影响也尚未明确。随着研究的深入，或许在不久的将来可以发现一种有效的联合诱导方法，使BMMSCs诱导分化的心肌样细胞具备良好的功能状态，从而发挥最大的治疗效果。研究目的1. SD大鼠BMMSCs体外分离、培养、纯化及鉴定。2.分别用5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞，检测分化率和心肌特异性蛋白表达。3.检测5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞的电生理特性。研究方法1. SD大鼠BMMSCs体外分离、培养、纯化及鉴定：采用脱颈法处死SD大鼠后分离四肢长骨，获取全骨髓细胞之后采用密度梯度离心法和差速贴壁法弃除骨髓中的其他细胞，得到纯化的BMMSCs。使用倒置相差显微镜每日观察BMMSCs在培养传代过程中细胞的形态学变化，并使用流式细胞仪检测BMMSCs表面标记抗原CD29(+)、CD44(+)和CD45(-)，进行细胞纯度鉴定。各组细胞经诱导后，形态由不规则星形逐渐成为长梭形，表现出心肌细胞的形态学特征。2. BMMSCs经5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导分化为心肌样细胞的分化率和心肌特异性蛋白表达：传代纯化之后取第4代细胞，分为5个实验组：5-AZA组(10μmol/L)，Ang-II组(0.1μmol/L)，PFT-α (20μmol/L)组，BMP-2(10μg/L)组和正常对照（Control）组。各实验组诱导24h后换正常完全培养液继续培养4w，倒置显微镜观察细胞形态学变化，采用流式细胞仪测定心肌样细胞分化率，Western Blot测定缝隙蛋白43(Cx43)和心肌肌钙蛋白I (cTnI)表达量，免疫荧光染色测定诱导后1w和4w肌钙蛋白T(cTn T)表达。3.检测5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞的电生理特性：取第4代细胞分组诱导第4w时，采用激光共聚焦测定反映各组细胞内游离钙离子浓度变化的fluo3/AM荧光表达水平，采用膜片钳测定各组细胞的钾通道电流密度水平。研究结果1. SD大鼠BMMSCs原代培养、传代形态学特点及表面抗原鉴定：原代细胞形状多成不规则星形或者短梭形，且可见细胞之间存在突起互相连接。原代细胞分离培养7d后快速增殖并形成集落，呈长梭形。传3~4代后细胞体积比原代细胞增大，细胞形态及生长排列趋向一致。采用流式细胞仪检测BMMSCs表面特异性抗原CD44、CD29和阴性表面抗原CD45，CD44阳性表达率为(91.4±1.2)%，CD29阳性表达率为(89.6±2.7)%，而CD45阳性表达率为(1.8±1.3)%。2.各组诱导分化率和心肌特异性蛋白表达：流式细胞仪测定各实验组细胞分化率，结果如下：5-AZA组分化率为(23.7±2.1)%，Ang-II组为(23.5±1.6)%，BMP-2组为(17.5±2.3)%，PFT-α组为(28.9±0.9)%，而对照组为(1.5±1.4)%。5-AZA组与Ang-II组之间无明显统计学差异(P>0.05)，其余各组之间具有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光染色检测各实验组细胞cTn T蛋白表达程度，结果显示除对照组外各组在诱导后1w均有弱表达，诱导后4w均有强表达，而对照组在诱导后1w和4w均为少量表达。Western Blot结果显示在诱导后4w，各实验组均有Cx43蛋白表达，5-AZA组蛋白表达量高于其他实验组(P<0.05)，PFT-α组表达量较BMP-2组和Ang-II组多(P<0.05)，而BMP-2表达量较Ang-II组多(P<0.05)，对照组表达量显著低于各实验组(P<0.01)。同时各实验组均有cTn I蛋白表达，PFT-α较其他各实验组表达量多(P<0.05)，5-AZA组与Ang-II组之间无明显差异(P>0.05)，BMP-2组较其他各实验组表达量较少(P<0.05)，对照组蛋白表达量显著低于实验组(P<0.01)。3.各组诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞的电生理特性：激光共聚焦显微镜检测fluo3荧光表达水平，结果显示5-AZA组荧光强度为(1686.177±499.122)，Ang-II组荧光强度为(2627.666±407.329)，PFT-α组荧光强度为(2156.606±385.355)，BMP-2组荧光强度为(1301.910±338.681)，而对照组中荧光强度为(824.928±222.399)。荧光强度Ang-II组高于其他实验组(P<0.01)，PFT-α组荧光强度显著比5-AZA组和BMP-2组高(P<0.01)，5-AZA组荧光强度显著较BMP-2组高(P<0.01)，对照组表达显著低于各实验组(P<0.01)。使用膜片钳检测各组细胞钾通道电流密度水平，结果显示，在+70mV时的稳态电流中，电流密度(pA/pF)在5-AZA组中为(24.931±1.421)，Ang-II组为(25.134±1.481)，PFT-α组为(27.102±1.321)，BMP-2组为(20.485±1.236)，而对照组中电流密度为(18.053±1.241)。电流密度PFT-α组最高，较其他组均有显著差异(P<0.01)，其中PFT-α组vs.Ang-II组(P<0.05)；5-AZA组和Ang-II组之间无显著差异(P>0.05)，较BMP-2组和对照组有显著差异(P<0.01)；BMP-2组比对照组电流密度强，具有显著差异(P<0.01)。研究结论1.采用密度梯度离心法和差速贴壁法联合使用可以得到纯化的原代BMMSCs，通过流式细胞仪测定BMMSCs的表面特异性抗原CD29(+)和CD44(+)以及CD45(-)可以鉴定分离培养的原代BMMSCs的纯度。2. BMMSCs经5-AZA (10μmol/L)，BMP-2(10μg/L)，PFT-α (20μmol/L)，Ang-II (0.1μmol/L)诱导可以向心肌样细胞分化。分化率PFT-α最高，5-AZA与Ang-II无明显差别，BMP-2分化率在实验组中最低。3.各实验组细胞游离钙离子浓度变化的荧光强度Ang-II> PFT-α>5-AZA> BMP-2> Control，经不同诱导剂作用后细胞内钙离子代谢水平较未诱导细胞有不同程度的提高。4.各实验组钾电流测定，电流密度PFT-α组最高，5-AZA组和ANG-II组其次，BMP-2组在实验组中最低。各诱导组均比对照组电流密度强，提示经诱导剂诱导之后细胞膜表面可开放钾通道数量分化成熟增多，使电流密度增强。