【摘 要】
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沙门氏菌（Salmonella）是引起全球人类腹泻的主要原因之一,严重危害人类健康。人类感染时可能会出现腹泻、腹部痉挛等症状,在患病严重时,甚至可能危及生命。沙门氏菌传统检测方法耗时长,步骤繁琐,因此开展快速简便灵敏的比色定性和定量检测方法,具有重要意义。本文首先设计与靶序列结合的探针,将其与金纳米粒子（gold nanoparticles,AuNPs）结合。利用跨越式滚环等温扩增方法（Salta
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沙门氏菌（Salmonella）是引起全球人类腹泻的主要原因之一,严重危害人类健康。人类感染时可能会出现腹泻、腹部痉挛等症状,在患病严重时,甚至可能危及生命。沙门氏菌传统检测方法耗时长,步骤繁琐,因此开展快速简便灵敏的比色定性和定量检测方法,具有重要意义。本文首先设计与靶序列结合的探针,将其与金纳米粒子（gold nanoparticles,AuNPs）结合。利用跨越式滚环等温扩增方法（Saltatory rolling circle amplification,SRCA）扩增出靶序列,其高温变性后成为单链,与金纳米粒子上的探针结合后,释放出金纳米粒子,在MgSO4的作用下其发生聚集,呈现肉眼可见的蓝色,判定为阳性,否则为紫色,判定为阴性,依此,优化反应条件,构建可视化检测方法;此外利用紫外分光光度计在A620和A530处分别测量其吸光度值,计算两者比值,或利用智能手机软件测量其RGB值（红绿蓝值）,分析B（蓝）/R（红）比值,据此,优化反应条件,构建定量检测方法。对建立的定性和定量检测方法进行评价。主要研究结果如下:（1）优化后的SRCA反应体系和条件为:Mg2+添加量为3.0 μL,dNTPs添加量为5.0 μL,反应温度63℃,反应时间40 min。优化后的比色反应体系和条件为:MgSO4浓度为6.7 mmol/L,探针浓度为5μmol/L,孵育时间和孵育温度分别为15 min和50℃,添加MgSO4溶液反应4 min后,呈现稳定的吸光度值。（2）特异性评价实验结果显示,8株沙门氏菌有明显的颜色变化和吸光度变化,呈阳性结果;8株非沙门氏菌颜色和吸光度无明显变化,呈阴性结果,表明该方法特异性良好;检测纯菌液灵敏度评价实验结果显示,肉眼可视化定性检测的灵敏度为 5.5 CFU/mL。沙门氏菌浓度在 5.5～5.5×106 CFU/mL 之间时,A620/A530 值、B/R值与菌液浓度对数的线性关系良好。采用吸光度定量测定的线性方程为y=0.011x+1.081（R2=0.9824）,其灵敏度为4.59 CFU/mL。采用智能手机RGB定量测定的线性方程为 y=0.0106x+1.0134（R2=0.9876）,其灵敏度为 5.50 CFU/mL（LOD=3S/k）。（3）在无菌牛奶中添加浓度为3.7～3.7 × 108 CFU/mL的沙门氏菌,进行人工污染试验,确定定性定量检测的检出限,肉眼可视化定性检测的检出限为3.7 CFU/mL。吸光度定量测定的线性方程为y=0.0168x+1.0893（R2=0.9877）,其检出限为2.63 CFU/mL,智能手机RGB定量测定的线性方程为y=0.0201x+1.215（R2=0.9859）,其检出限为3.02 CFU/mL。（4）实际样品检测试验,使用本研究建立的方法对50份市售实际样品进行检测,并与《GB 4789.4-2016》法对比,本研究建立的方法敏感性为100.00%、特异性为97.87%、符合率达到98.00%。本研究建立的金纳米粒子探针结合SRC A扩增比色法定性定量检测食品中的沙门氏菌方法,特异性较强、灵敏度较高、耗时较短、操作简便。通过肉眼观察颜色变化实现了可视化定性检测,通过吸光度或RGB分析实现了定量检测,适合于基层单位或检测机构应用。
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