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果实颜色作为辣椒果实的重要性状之一，长期以来受到育种家和消费者的关注。鲜艳的颜色不仅能够增强果实的商品性，同时也可作为评判果实成熟的重要指标。大量研究表明叶绿素、类黄酮及类胡萝卜素与辣椒果实颜色的形成紧密相关，因此开展叶绿素、类黄酮及类胡萝卜素合成相关分子机理的研究对改善辣椒果实色泽及提高辣椒的经济价值具有重大的意义。本研究通过集群分离分析(bulked segregant analysis, BSA)结合RNA测序的方法(BSR-seq)对叶绿素及类胡萝卜素合成相关的基因进行定位。同时以4个不同果实颜色辣椒品种为研究材料，基于靶向代谢组及转录组测序技术对辣椒果实中类黄酮和类胡萝卜素的合成及调控机制进行研究。本研究的主要内容和结果如下：
(1)辣椒果实滞绿基因的精细定位及候选分析。本研究从辣椒种质资源库中筛选到一个命名为TNX348的果实滞绿突变体，遗传分析表明TNX348的滞绿性状由单隐性基因控制。利用TNX348构建的F2群体进行滞绿基因的精细定位，BSR-seq和连锁分析结果显示辣椒果实滞绿基因被定位在Caps6649159和Indel6780656两个标记之间约131kb的区域内。区间基因测序发现滞绿突变体中暗诱导的叶绿体蛋白基因CaSGR1(Capana01g000359)编码区存在单碱基突变，并且该SNP在F2群体中与滞绿性状共分离，此外果实发育过程中CaSGR1在TNX348中的表达被显著抑制，因此将CaSGR1确定为控制果实滞绿的候选基因。
(2)果实发育过程中滞绿突变体TNX348及非滞绿材料HJ10-1中基因的表达模式分析。为解析辣椒果实中叶绿素的降解及调控机制，在绿熟、转色和生理成熟阶段对TNX348与HJ10-1进行转录组测序。3个果实发育阶段TNX348与HJ10-1之间分别检测到2295、6728和4506个差异表达基因。KEGG富集分析显示差异表达基因在叶绿素代谢及植物激素信号转导通路中显著富集，表明除叶绿素代谢结构基因外植物激素信号转导因子也参与叶绿素的降解。进一步的表达分析显示NAC转录因子、ABI(ABA insensitive)、ABF(ABA responsive element-binding factor)等11个激素信号转导因子与CaSGR1等基因具有相同或相反的表达模式，表明ABI、ABF和NAC激素信号因子可能通过调控CaSGR1等基因的表达参与叶绿素的降解。
(3)辣椒红色果实控制基因的遗传分析与定位。为定位辣椒红色果实控制基因，构建了一个F2果实颜色分离群体。遗传分析表明辣椒红色果实性状由单显性基因控制。基于BSR-seq及连锁分析的方法，辣椒红色果实控制基因被定位在Indel9224993与Caps9964566标记之间约739kb的区域内，该区段内包含辣椒红素合成酶(CCS)基因。测序分析发现CCS基因在黄色果实自交系TLIUS2F-1中存在缺失，并且自交系TLIUS2F-1中未检测到辣椒红素的积累，因此将CCS确定为控制红色果实的候选基因。
(4)4个不同颜色辣椒品种果实中类黄酮的积累及相关基因的表达分析。利用LC-MS技术对4个不同颜色辣椒品种果肉中的类黄酮进行定性和定量分析，两个果实发育阶段4个辣椒品种果实中总共检测到188种类黄酮，其中花青素、黄酮醇及黄酮等化合物在紫色果实品种CJ12-17-1中的含量显著高于其他颜色的品种。类黄酮合成相关基因表达模式分析表明，苯丙烷合成途径中苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、香豆素CoA连接酶(4CL)基因及类黄酮代谢通路二氢类黄酮4-还原酶(DFR)、UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST2)基因的高表达导致花青素、黄酮醇及黄酮等化合物在CJ12-17-1果实中高积累。
(5)辣椒果实转录组与靶向代谢组的关联分析。为解析辣椒果实中类黄酮的合成调控网络，将检测到的差异表达基因与差异积累的类黄酮进行相关性分析，在两个果实发育阶段4308个差异表达基因与类黄酮的积累存在高的相关性。基于4308个差异表达基因的加权基因共表达网络分析(WGCNA)，两个模块被确定与类黄酮的合成呈正相关，模块中Capana10g001281(SLC40)、Capana10g001433(MYB113)、Capana03g001813(WDR68)等26和23个基因分别编码转运蛋白和转录因子，并且处在调控网络的核心位置，表明这些转运蛋白基因及转录因子可能参与调控类黄酮的合成与转运。
(6)不同颜色辣椒果实中类胡萝卜素的积累及相关基因的表达分析。为解析辣椒果实中类胡萝卜素的合成及调控机制，利用LC-MS技术对4个不同颜色辣椒品种果肉中的类胡萝卜素进行定量分析，结果显示生理成熟阶段类胡萝卜素的积累展现出显著的颜色特异性。α-胡萝卜素、叶黄素及紫黄质等黄色或橙色的类胡萝卜素在黄色及橙色果实中显著积累，而红色的辣椒红素则在红色果实中高表达。类胡萝卜素结构基因的表达模式显示番茄红素ε-环化酶(LCYE)和番茄红素β-环化酶1(LCYB1)在黄色材料中高表达，而番茄红素β-环化酶2(LYCB2)在红色材料具有更高的转录丰度，表明LYCB2和(LCYE和LCYB1)通过分别介导流入β，ε胡萝卜素分支和β，β胡萝卜素分支的通量，进而影响α-胡萝卜素、叶黄素和辣椒红素等类胡萝卜素在果实中的积累。此外，果实发育过程中4个辣椒品种的CCS基因均被显著上调，但仅红色果实中具有较高的辣椒红素含量，表明辣椒红素的积累不单取决于CCS的转录水平，还与翻译后CCS酶的活性相关。
(1)辣椒果实滞绿基因的精细定位及候选分析。本研究从辣椒种质资源库中筛选到一个命名为TNX348的果实滞绿突变体，遗传分析表明TNX348的滞绿性状由单隐性基因控制。利用TNX348构建的F2群体进行滞绿基因的精细定位，BSR-seq和连锁分析结果显示辣椒果实滞绿基因被定位在Caps6649159和Indel6780656两个标记之间约131kb的区域内。区间基因测序发现滞绿突变体中暗诱导的叶绿体蛋白基因CaSGR1(Capana01g000359)编码区存在单碱基突变，并且该SNP在F2群体中与滞绿性状共分离，此外果实发育过程中CaSGR1在TNX348中的表达被显著抑制，因此将CaSGR1确定为控制果实滞绿的候选基因。
(2)果实发育过程中滞绿突变体TNX348及非滞绿材料HJ10-1中基因的表达模式分析。为解析辣椒果实中叶绿素的降解及调控机制，在绿熟、转色和生理成熟阶段对TNX348与HJ10-1进行转录组测序。3个果实发育阶段TNX348与HJ10-1之间分别检测到2295、6728和4506个差异表达基因。KEGG富集分析显示差异表达基因在叶绿素代谢及植物激素信号转导通路中显著富集，表明除叶绿素代谢结构基因外植物激素信号转导因子也参与叶绿素的降解。进一步的表达分析显示NAC转录因子、ABI(ABA insensitive)、ABF(ABA responsive element-binding factor)等11个激素信号转导因子与CaSGR1等基因具有相同或相反的表达模式，表明ABI、ABF和NAC激素信号因子可能通过调控CaSGR1等基因的表达参与叶绿素的降解。
(3)辣椒红色果实控制基因的遗传分析与定位。为定位辣椒红色果实控制基因，构建了一个F2果实颜色分离群体。遗传分析表明辣椒红色果实性状由单显性基因控制。基于BSR-seq及连锁分析的方法，辣椒红色果实控制基因被定位在Indel9224993与Caps9964566标记之间约739kb的区域内，该区段内包含辣椒红素合成酶(CCS)基因。测序分析发现CCS基因在黄色果实自交系TLIUS2F-1中存在缺失，并且自交系TLIUS2F-1中未检测到辣椒红素的积累，因此将CCS确定为控制红色果实的候选基因。
(4)4个不同颜色辣椒品种果实中类黄酮的积累及相关基因的表达分析。利用LC-MS技术对4个不同颜色辣椒品种果肉中的类黄酮进行定性和定量分析，两个果实发育阶段4个辣椒品种果实中总共检测到188种类黄酮，其中花青素、黄酮醇及黄酮等化合物在紫色果实品种CJ12-17-1中的含量显著高于其他颜色的品种。类黄酮合成相关基因表达模式分析表明，苯丙烷合成途径中苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、香豆素CoA连接酶(4CL)基因及类黄酮代谢通路二氢类黄酮4-还原酶(DFR)、UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST2)基因的高表达导致花青素、黄酮醇及黄酮等化合物在CJ12-17-1果实中高积累。
(5)辣椒果实转录组与靶向代谢组的关联分析。为解析辣椒果实中类黄酮的合成调控网络，将检测到的差异表达基因与差异积累的类黄酮进行相关性分析，在两个果实发育阶段4308个差异表达基因与类黄酮的积累存在高的相关性。基于4308个差异表达基因的加权基因共表达网络分析(WGCNA)，两个模块被确定与类黄酮的合成呈正相关，模块中Capana10g001281(SLC40)、Capana10g001433(MYB113)、Capana03g001813(WDR68)等26和23个基因分别编码转运蛋白和转录因子，并且处在调控网络的核心位置，表明这些转运蛋白基因及转录因子可能参与调控类黄酮的合成与转运。
(6)不同颜色辣椒果实中类胡萝卜素的积累及相关基因的表达分析。为解析辣椒果实中类胡萝卜素的合成及调控机制，利用LC-MS技术对4个不同颜色辣椒品种果肉中的类胡萝卜素进行定量分析，结果显示生理成熟阶段类胡萝卜素的积累展现出显著的颜色特异性。α-胡萝卜素、叶黄素及紫黄质等黄色或橙色的类胡萝卜素在黄色及橙色果实中显著积累，而红色的辣椒红素则在红色果实中高表达。类胡萝卜素结构基因的表达模式显示番茄红素ε-环化酶(LCYE)和番茄红素β-环化酶1(LCYB1)在黄色材料中高表达，而番茄红素β-环化酶2(LYCB2)在红色材料具有更高的转录丰度，表明LYCB2和(LCYE和LCYB1)通过分别介导流入β，ε胡萝卜素分支和β，β胡萝卜素分支的通量，进而影响α-胡萝卜素、叶黄素和辣椒红素等类胡萝卜素在果实中的积累。此外，果实发育过程中4个辣椒品种的CCS基因均被显著上调，但仅红色果实中具有较高的辣椒红素含量，表明辣椒红素的积累不单取决于CCS的转录水平，还与翻译后CCS酶的活性相关。