研究背景肺炎是一种常见的感染性疾病,是世界范围内儿童发病和死亡的首要原因,其特点是高致病性和高死亡率。肺炎支原体(Mycoplasma penumoniae,M.pneumoniae,MP)是人类支原体肺炎的病原体,是社区获得性肺炎的重要病原,10-30%的社区获得性肺炎由其引起。肺炎支原体肺炎(Mycoplasma penumoniae pneumonia,MPP)的病理改变主要以间质性肺炎为主,又称为原发性非典型性肺炎。全年都可能发生,但是多出现在秋冬季节。传播途径主要是通过飞沫传染,潜伏期约为2～3周,在青少年中发病率最高。肺炎支原体感染一般呈自限性过程,预后良好。近年来发现,尽管现代医学技术和抗感染药物研发取得了长足的进展,重症肺炎支原体肺炎和难治性支原体肺炎(Refractory mycoplasma pneumoniae pneumonia,RMPP)逐年明显增多,在合理应用大环内酯类抗生素治疗后病情仍未见好转,不但引起胸腔积液、肺不张、肺实变等肺内并发症,还会引起心肌炎、肾炎、免疫性溶血性贫血等肺外并发症,肺部后遗症的报道也越来越多,如单侧透明肺、闭塞性细支气管炎、坏死性肺炎等等。肺炎支原体感染存在着复杂的发病机制,至今尚未完全清楚,是目前研究的重点。有学者认为肺炎支原体感染后患儿病情危重可能与肺炎支原体感染的菌体载量、对大环内酯类抗生素耐药、宿主过强的免疫炎症反应以及混合感染等有关。影响支原体感染的危险因素众多,总起来说,存在内因及外因两方面的因素。内因方面,既往研究已表明遗传因素在感染性疾病的发生和转归中的作用不容忽视,甚至是决定性的。部分人群MPP的发生率明显升高,即使予以及时有力的抗生素治疗及支持治疗,病死率仍较高。临床上关于肺炎支原体对大环内酯类药物耐药的报道逐渐增多,目前研究推测肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药的分子基础主要是红霉素作用靶位23S rRNA的V区基因的2063和2064位点发生了点突变。这些均提示遗传因素与MPP的发生及及病情演变可能存在一定相关性。目前,探讨遗传因素与肺炎支原体肺炎的关系的研究罕见,且结论并不一致。免疫紊乱是MPP的重要发病机制。细胞因子网络失衡参与MPP的发生、进展及转归,所以研究MPP众多疾病状态下细胞因子的动态变化,是非常重要的。国内外研究表明,支原体感染后引起白细胞介素家族中多种细胞因子的过量分泌,影响着疾病的发生、进展及预后,RMPP的发病机制可能与这些细胞因子密切相关。儿童重症MPP的早期识别、早期干预对治疗非常重要,目前,经济、可重复、值得信赖的临床检测预测方法仍十分欠缺。近年来随着纤维支气管镜及支气管肺泡灌洗术的广泛开展,探讨肺泡灌洗液中各细胞因子的变化,为重症MPP患儿的早期诊断和治疗提供了新的途径。外因方面,2010以来,全球范围不断出现大规模的肺炎支原体感染流行。其高峰平均每3～7年在全球出现1次。口前,导致支原体肺炎发病率波动的机制尚未确定,人们认为肺炎支原体的基因型可能正在改变,在每一次流行中均会产生不同的遗传物质。国内外关于肺炎支原体基因亚型与MPP临床严重程度相关性的研究较少,少有系统的大样本的研究报告。且现有的研究结论不一。国外曾有学者研究发现肺炎支原体感染的临床严重程度与肺炎支原体拷贝量有一定的相关性,与肺炎支原体亚型无明显相关性,但这项研究是针对于大部分中青年人群,考虑儿童与成人发育及发病情况存在差异,故不适用于儿童。临床确定肺炎支原体的类型对于了解肺炎支原体感染的流行病学和地方性暴发的分析是非常重要的。山东地区亦尚缺乏大样本的流行病学调查资料,因此探讨山东地区肺炎支原体流行亚型,及其是否存在基因变异情况,同时收集不同型别MPP患儿的临床资料,探讨肺炎支原体亚型与疾病严重程度之间的相互关系,以助于了解目前我国肺炎支原体亚型分布及流行特征,促进暴发的识别,予以预警和及时实施控制,同时可促进我国免疫预防的发展,对疫苗的研制提供有益的帮助。研究目的本研究中我们一方面从遗传学角度研究基因多态性与支原体肺炎的相关性,为支原体感染的预防控制、早期诊断和治疗提供多方位的论证;另一方面对山东地区支原体肺炎患儿肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行肺炎支原体P1基因分型及基因测序,探讨山东地区肺炎支原体流行亚型及其基因变异情况;同时收集不同型别肺炎支原体感染患儿的临床资料,探讨肺炎支原体亚型与疾病严重程度之间是否存在相关性。目前对儿童支原体肺炎在病原学及解剖结构方面报道较多,而BALF中细胞因子变化的研究尚不多。通过对支原体肺炎患儿BALF中IL-6、IL-27水平的检测,探究各种疾病状态下IL-6与IL-27的水平变化情况,比较各组细胞因子水平有无差异性,评估IL-6与IL-27的水平与重症支原体肺炎的发生是否具有相关性,能否反应该疾病的严重程度,尽可能的发掘更多的重症支原体肺炎识别方法,争取能为重症支原体肺炎早期发现、诊断及治疗提供更多的论据。研究对象及方法本研究主要分为三个部分,第一部分中,我们采用病例-对照研究方法,收集2014年10月至2016年6月间于山东大学齐鲁儿童医院住院的415例支原体肺炎患者外周静脉血标本,其中重症肺炎205例,非重症肺炎210例,同时收集儿保门诊健康查体300例健康儿童的外周血标本,以415例支原体肺炎患者和300例健康儿童为研究对象,提取各研究对象的基因组DNA,应用聚合酶链反应及测序方法对ACErs4340、GSTM1(Ins/del)、IL-6(rs1800795)、NOS3(rs1799983)及 CYP1A1(rs2606345)进行基因分型,用SPSS统计软件分析各多态性位点与MPP严重程度的相关性,从宿主层面来分析某些特定人群对支原体感染有无易感性,及与肺炎严重程度有无相关性。第二部分于山东大学齐鲁儿童医院住院部收集2015-2016年肺炎患儿的肺泡灌洗液,对诊断为MPP的240例患儿肺泡灌洗液标本进行P1基因分型,并进行基因测序,探讨此期间山东地区肺炎支原体流行亚型及其基因变异情况;同时收集该组患儿的临床资料,分析肺炎支原体亚型与疾病严重程度之间的相互关系。数据用SPSS 22.0软件进行分析,采用卡方检验和方差分析的方法来分析临床症状和人口统计学数据(年龄和性别)。第三部分为了探讨儿童肺炎支原体与肺泡灌洗液中细胞因子之间的相互关系,选择临床采集的无肺部病变的支气管异物患儿与MPP患儿的肺泡灌洗液作为对照组与研究组,采用酶联免疫分析(ELISA)技术监测MPP患儿BALF中IL-6、IL-27水平,收集各组支原体肺炎患儿是否混合感染,病情轻重及肺泡灌洗液中MP-DNA拷贝值等临床及实验数据。ELISA检测结果采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理,连续性正态分布的计量资料数据以均数±标准差表示。多组间均数比较采用单因素方差分析,多组均数的两两比较采用LSD检验方法。研究结果第一部分中,我们研究发现,ACErs4340、NOS3rs1799983、CYP1A1rs2606345 存在三种基因型,但 IL-6rs1800795 和 GSTM1 基因(Ins/del)只有野生型和杂合型。对照组各单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisin,SNP)基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。病例和对照组中,ACErs4340 ID(42.67%vs 54.22%,OR=1.81,95%CI:1.31-2.48,P<0.001),IL-6rs1800795 GC(1.33%vs 5.78%,OR=4.54,95%CI:1.56-13.23,P=0.003),NOS3rs1799983 TT(3.200%vs 8.82%,OR=6.53,95%CI:1.95-21.87,P<0.001)和等位基因的分布ACErs4340 I(OR=1.32,95%CI:1.06-1.65,P=0.014)/NOS3rs1799983 T(OR=1.48,95%CI:1.07-2.05,P =0.018)/IL-6rs1800795 C(OR=4.44,95%CI:1.53-12.86,P= 0.0027)比较有统计意义,表明 ACErs4340 ID、IL-6rs1800795 GC和NOS3rs1799983 TT与MPP的风险增加有关。而对于GSTM1(Ins/del)和CYP1A1 rs2606345 G/T,病例组和对照组比较基因型分布无明显差异,Logistic回归也未发现这两个多态位点与MPP易感性相关。我们继续分析 ACErs4340、GSTM1 基因(Ins/del)、IL-6rs1800795、NOS3rs1799983和CYPIA1 rs2606345各基因-基因之间的相互作用。等位基因频率组合表示,ACErs4340D/NOS3rs1799983T/CYP1A1 rs2606345G(OR=3.08,95%CI:1.80-5.26);ACErs4340D/NOS3 rs1799983T(OR=3.44,95%CI:2.01-5.89)基因携带者,MPP患病风险明显高于对照组。应用MDR分析软件继续探讨这一群体中研究基因的SNP-SNP的交互作用。最终,ACErs4340及NOS3rs1799983被认定为与MPP发病风险最大(CV consisitency = 9/10)。同时使用 SAS 软件(version9.1.3 portable)分析各SNP组合后的发病风险,结果表明ACErs4340和NOS3rs11799983遗传多态性的组合频率在MPP病人(n= 415)病例和对照组之间存在显著差异(OR=3.32,95%CI:1.90-5.85)。此外,在415例MPP患者中,我们分析了各多态位点与MPP病情严重程度的关系,发现,ACErs4340 Ⅰ等位基因携带者,严重MMP发生的风险要高1.44 倍(OR=1.44,95%CI:1.05-1.97,P=0.024),IL-6rs1800795 C等位基因携带者,发生严重MMP的风险要高6.9倍(OR=6.9,95%CI:2.14-22.22,P=0.001)。综上所述,本研究提示SNP在MPP高风险个体筛查中的潜在应用价值。第二部分通过巢式多重PCR方法对240例MPP患儿肺炎支原体P1分型检出P1-Ⅰ型228例,P1-Ⅱ型12例。研究表明,在研究期间,山东地区发生的MP感染以P1-Ⅰ型为主,未发现变异株。这一结果与欧洲某些国家,以及中国北京、浙江、天津等地区学者监测结果相同。进一步分析发现P1-Ⅱ型中重症比例高于P1-Ⅰ型,肺炎支原体P1亚型与肺部感染严重程度可能存在相关性,差异有统计学意义(P=0.018<0.05)。第三部分本研究BALF中的IL-6水平可反映MPP患者肺部感染程度,IL-6水平越高,肺部感染程度越重,高水平的IL-6与重症MPP的发生具有相关性,未发现IL-27水平与重症MPP的发生具有相关性;进一步分组分析,单纯支原体感染与混合支原体感染,都存在IL-6水平升高,混合感染相对于单纯感染,有统计学意义,而IL-27在混合感染组降低明显,与单纯组比较差异无统计学意义,与对照组比较有显著差异;肺泡灌洗液的MP-DNA拷贝值,其高低与IL-6分泌水平存在相关性,而与IL-27无相关性。研究结论1.ACErs4340,IL-6rs1800795 和 NOS3rs1799983 的多态性与 MPP 易感性存在统计学关联;2.交互分析证明,儿童ACErs4340D/NOS3rs1799983T基因携带者,MPP患病风险明显增高;3.ACErs4340 Ⅰ及IL-6 rs1800795 C等位基因携带者,发生重症MMP的风险要高;4.研究期间,山东地区发生的MP感染以P1-Ⅰ型为主,未发现变异株。P1-Ⅱ型中重症比例高于P1-Ⅰ型,肺炎支原体P1亚型与肺部感染严重程度可能存在相关性,差异有统计学意义。5.本研究未发现BALF中的IL-27水平与重症MPP发生具有相关性,而IL-6与重症MPP的发生具有相关性,可作为预测重症MPP发生的标志物。