【摘 要】
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目的:运用现代中药学研究方法、高效液相、体外细胞培养及流式细胞检测等分子生物学实验技术,探索爬行卫矛多糖的提取工艺、单糖组成及体外抗氧化能力,并研究其对人卵巢腺癌细胞（SKOV3）的影响,为进一步开发作用机制明确的新型抗氧化及抗人卵巢腺癌相关疾病药物提供理论依据。方法:（1）通过单因素试验,分别得到爬行卫矛多糖提取的最佳料液比、最佳提取温度、最佳超声功率、最佳提取时间,并在此基础上以爬行卫矛多糖提
【基金项目】
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项目名称:壮瑶药扶芳藤抗衰老有效成分及其作用机制的研究,项目合同编号:81360688,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2014/1-2017/12
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目的:运用现代中药学研究方法、高效液相、体外细胞培养及流式细胞检测等分子生物学实验技术,探索爬行卫矛多糖的提取工艺、单糖组成及体外抗氧化能力,并研究其对人卵巢腺癌细胞（SKOV3）的影响,为进一步开发作用机制明确的新型抗氧化及抗人卵巢腺癌相关疾病药物提供理论依据。方法:（1）通过单因素试验,分别得到爬行卫矛多糖提取的最佳料液比、最佳提取温度、最佳超声功率、最佳提取时间,并在此基础上以爬行卫矛多糖提取率为评价指标,以料液比、提取温度、超声功率、提取时间为影响因素,正交试验L9（3~4）法优化提取工艺,确定爬行卫矛多糖提取的最佳条件。并在此条件下,以AB-8大孔树脂提纯爬行卫矛多糖。（2）通过精密度、重复性、稳定性及回收率试验,考察PMP柱前衍生高效液相色谱分析方法,并以该方法分析爬行卫矛多糖的单糖组成。（3）通过考察DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基抑制率、还原力、羟自由基抑制率研究爬行卫矛多糖的体外抗氧化能力并与VC、BHT、枸杞多糖及黄芪多糖比较。（4）通过CCK-8检测技术检测爬行卫矛多糖对SKOV3细胞增殖的影响,并以流式细胞检测技术检测爬行卫矛多糖对SKOV3细胞周期的影响。结果:（1）爬行卫矛多糖的最优提取工艺:提取温度80℃,超声功率144 W,料液比1:60（g/m L）,提取时间75 min,提取次数2次。在最优提取工艺条件下,爬行卫矛多糖提取率为2.627%。多糖经AB-8大孔树脂提纯后纯度达53.47%。（2）经考察发现,PMP柱前衍生高效液相色谱分析方法的精密度、重复性、稳定性及回收率均达到要求。经该法分析,可知爬行卫矛多糖包含D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖,含量分别为13.364、39.460、21.938、5.085、3.486、0.610mg/g,其中D-葡萄糖的含量最高（39.460mg/g）,L-鼠李糖的含量最低（0.610mg/g）。将爬行卫矛多糖中单糖的含量换算成摩尔比D-半乳糖:D-葡萄糖:D-阿拉伯糖:D-甘露糖:L-岩藻糖:L-鼠李糖为21.82:64.41:42.97:8.29:6.24:1。（3）通过体外抗氧化试验发现,在0.1～1mg/m L的溶液浓度范围内,对DPPH自由基抑制率结果为枸杞多糖>黄芪多糖>爬行卫矛多糖≈BHT;对超氧阴离子自由基抑制率的结果为VC>爬行卫矛多糖>枸杞多糖≈黄芪多糖;还原力的结果为BHT>爬行卫矛多糖>黄芪多糖≈枸杞多糖。在溶液浓度为0.05～0.4mg/m L的范围内,对羟自由基抑制率的结果为VC>爬行卫矛多糖>黄芪多糖≈枸杞多糖。爬行卫矛多糖具有较高的DPPH自由基清除活性（47.12%,1mg/m L）和超氧阴离子自由基清除活性（29.59%,1mg/m L）,还原力（吸光度OD值A700nm为1.081,1mg/m L）和羟基自由基清除活性（59.38%,0.4mg/m L;IC50:0.3204mg/m L）。（4）通过CCK-8法检测,爬行卫矛多糖可抑制SKOV3细胞增殖,且与多糖浓度及培养时间呈正相关,SKOV3细胞在1000μg/m L爬行卫矛多糖培养液培养96 h,增殖抑制率最高达到72.61%。通过流式细胞检测技术检测多糖对SKOV3周期的影响,发现SKOV3细胞经多糖培养72 h,对其细胞周期出现显著影响,与空白对照组比较,G0/G1期细胞数显著增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:在提取温度80℃,超声功率144 W,料液比1:60（g/m L）,提取时间75 min,提取次数2次的最优提取工艺条件下,爬行卫矛多糖提取率为2.627%,经AB-8大孔树脂提纯后纯度达53.47%;爬行卫矛多糖包含D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-岩藻糖及L-鼠李糖6种单糖,摩尔比为21.82:64.41:42.97:8.29:6.24:1;爬行卫矛多糖具有较强的体外抗氧化能力,可抑制SKOV3细胞增殖,使其G0/G1期细胞数增多,表现出对人卵巢腺癌细胞SKOV3的增殖抑制作用,且可使人卵巢腺癌细胞SKOV3细胞分裂阻滞于G0/G1期。
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