第一部分南大洋表层海水微生物群落的生物地理学特征海洋是一个连续的水环境,孕育了大量的微生物,是研究微生物群落相似性距离衰减规律的理想场所。有研究发现南海1,000 km海域中的微生物群落不存在相似性距离衰减规律。但是尚不清楚在更大的距离尺度上是否具有微生物群落相似性距离衰减规律。南大洋是一个连续无障碍的开放海域,覆盖了全球面积的8%,是在大尺度距离上研究微生物地理分布模型天然而又理想的场所。本文对最大水平距离约为7,800km的21个南大洋表层海水微生物样品进行了生物地理学研究。发现南大洋表层海水微生物群落存在相似性距离衰减规律,并研究了产生这种地理分布模式的原因。一、南大洋微生物群落结构变形菌门和拟杆菌门是南大洋表层海水中相对丰度最高的两个门,其中变形菌门占细菌总量的52.6%-92.5%,γ变形菌纲占变形菌门的40.9%-82.7%,α变形菌纲占变形菌门的16.8%-58.5%;拟杆菌门占细菌总量的3.5%-46.9%,在拟杆菌门中黄杆菌纲占65.9%-98.9%。在属水平上,数量最多的是γ变形菌纲中的海单胞菌,平均相对丰度为16.1±10.6%。二、细菌群落多样性的距离衰减规律位点间共有OTU数目与位点间距离具有显著的负相关关系,两个位点间距离越近共有OTU越多。3号和4号位点间相距334 km,共有OTU数量最多,为187个;2号和18号位点间相距6,870 km,共有OTU数量最少,为95个。通过构建微生物群落间Bray-Curtis相似性与位点间距离的关系,发现了显著的微生物群落相似性距离衰减规律。与位点间共有OTU数据一致,3号和4号位点具有最高的微生物群落相似性,76.5%;2号和18号位点之间具有最低的微生物群落相似性,35.5%。南大洋微生物群落的生态类型会影响群落多样性的大小:以丰富OTU为研究对象会增加微生物群落间的相似性（53.5%-85.9%）,利用稀有OTU为研究对象会降低微生物群落间的相似性（2.8%-38.3%）。但是利用丰富OTU和稀有OTU亚群落为研究对象时,都可以检测到微生物群落的相似性距离衰减规律。三、空间距离对微生物群落相似性距离衰减规律的影响以全部OTU、丰富OTU和稀有OTU三种生态类型的群落为研究对象,研究空间距离与微生物群落间相似性的相关性。发现当空间距离小于2,000 km时,群落间微生物群落相似性与微生物距离之间的距离衰减规律不显著;当空间距离超过2,000 km时群落间出现显著的相似性距离衰减规律。这说明在南大洋表层海水中洋流可以将距离在2,000 km以内的微生物充分混合。但是当距离超过2,000km后,微生物群落变异的速度会超过洋流将群落混合的速度,开始出现微生物群落相似性距离衰减规律。四、影响南大洋表层海水微生物群落异质性的因素距离因素和环境因素是影响微生物群落异质性的两个重要因素。通过主成分分析和聚类分析发现南大洋表层海水微生物具有地域分布特征,地理位置临近的位点更趋于聚类。通过典范对应分析发现,温度和盐度两个环境参数可以解释19.1%的微生物群落异质性。通过mantel检测,发现距离因素与环境因素都会显著影响微生物群落异质性。通过基于冗余分析的变异划分分析,研究了距离因素与环境因素对微生物群落异质性产生的权重。空间距离对不同生态类群的微生物群落异质性的解析度为:所有OTU,31.2%;丰富OTU,39.3%。环境参数对不同生态类群的微生物群落异质性的解析度为:所有OTU,8.7%;丰富OTU,9.0%。距离因素相比于环境因素可以解释更多的微生物群落异质性,说明南大洋微生物群落异质性主要是由空间距离造成的。第二部分Myroides profundi D25适应深海高压环境的机制深海是地球上最大的生态系统,大约1 029个微生物生活在深海生态环境中。高静水压会对微生物造成非常大的损伤,生活在深海的微生物必须适应深海高静水压环境。为了在高压环境下生存,深海微生物进化出一系列适应策略,例如增加细胞膜的流动性,调整细胞代谢途径等。然而,在深海微生物基因组中还没有发现与深海适应有关的标志性基因。三甲胺（TMA）和氧化三甲胺（TMAO）是海洋中重要的含氮有机分子,在海洋中广泛分布且在海洋生命中起重要作用。例如,TMA和TMAO可以为微生物提供碳氮源,TMAO可以作为电子受体供给微生物厌氧呼吸;而深海动物可以在细胞内富集TMAO用以稳定胞内蛋白质结构,从而适应深海高压环境。Myroidesprofundi D25属于拟杆菌门,是一株分离于冲绳海槽海域1,245 m深处沉积物的菌株。D25菌株可以在4℃、12MPa环境下生长,说明此菌株可以适应深海低温、高压环境。本文以D25菌株为研究对象,发现D25菌株的TMA代谢途径与其适应深海高静水压有关。一、D25菌株通过在胞内积累TMAO适应高静水压环境TMA和TMAO在海洋中广泛分布并且可以被海洋玫瑰杆菌类群细菌作为营养物质吸收代谢。与菌株Ruegeriapomeroyi DSS-3不同,D25菌株不能利用TMA和TMAO为碳氮源生长。但是当在培养基中加入TMA培养D25菌株时,培养基中的TMA可以被D25菌株吸收并在细胞内积累TMAO。我们进一步分析了细胞内积累TMAO是否与D25菌株适应高压环境有关。在培养基中加入TMA可以提高D25菌株在10-30 MPa压力下的生长速率及其在50MPa压力下的存活率。另外,高静水压会影响D25菌株细胞分裂,处于分裂状态的细胞比例从常压下的30%下降到了 10 MPa下的9.2%和30 MPa下的7.3%。但是,当TMA加入到培养基中后,在同样的压力条件下处于分裂状态的D25细胞比例明显提高。在10 MPa下添加TMA后处于分裂状态的细胞比例从9.2%提高到了 26.2%;在30 MPa下添加TMA后处于分裂状态的细胞比例从7.3%提高到了 13.8%。这些结果表明,D25菌株通过吸收培养基中添加TMA在胞内积累TMAO,可以提高其对高静水压的耐受能力。二、D25菌株中TMA转运蛋白的鉴定与性质表征高压环境会促进D25菌株吸收TMA,在胞内富集TMAO实现耐压的功能,因此压力可能会诱导TMA转运蛋白的表达。通过对高压下D25菌株的转录组数据分析发现,当压力升高时,D25菌株有533个基因显著上调表达,430个基因显著下调表达。在533个上调表达的基因中有38个编码转运蛋白的基因。其中编码 BCCT 型转运蛋白（TMA transporter,TmaT）的基因（Locustag:MPR0426,tmaT）上调表达7.9倍。RT-qPCR分析进一步证实高压可以诱导tmaT基因上调表达。因此tmaT基因可能是TMA转运蛋白并参与D25菌株的高压适应。利用等温热滴定技术检测了 TmaT蛋白与底物的结合能力。TmaT蛋白表现出对底物TMA结合能力,但是对其他季胺碱如TMAO、胆碱、肉毒碱、甜菜碱等没有结合能力。说明TmaT蛋白是TMA底物的特异性转运蛋白。另外,在5℃、15℃和25℃温度下,TmaT结合TMA的Kd值分别为36.4 μM、189 μM和660μM。表明TmaT蛋白在低温下可以更好地转运底物TMA,与D25菌株所处的深海低温环境相适应。三、D25菌株中三甲胺单加氧酶鉴定与性质表征细菌三甲胺单加氧酶（TMA monooxygenase,Tmm）是一种胞内水溶蛋白,催化TMA氧化到TMAO,在海洋玫瑰杆菌类群和SAR11类群细菌中广泛存在。分析D25的基因组表明,在D25菌株中存在一个编码Tmm的基因Mptmm（Locus tag:MPR3295,Mptmm）。TMA和高静水压都会诱导Mptmm基因显著上调表达,说明Mptmm编码的MpTmm可能参与胞内TMA的代谢并且可能参与细菌耐压。对异源表达的MpTmm的活性分析表明,MpTmm能将TMA氧化生成TMAO,说明MpTmm是一个三甲胺单加氧酶。对MpTmm蛋白进行了晶体结构解析,得到了分辨率为1.69 ?的晶体结构。MpTmm晶体与Roseovarius nubinhibens ISM菌株中的RnTmm晶体结构之间均方根差为0.8 A。辅因子FAD和NADP+在两个晶体结构中处于相同的位置。说明MpTmm蛋白与Rn Tmm蛋白功能一致,具有氧化TMA生成TMAO的功能。MpTmm蛋白表现出适应深海低温、高压的特征。MpTmm蛋白变性温度较低,Tm值为42±0.05℃。MpTmm蛋白对底物TMA的最适酶活温度为25℃,在0-5℃时可以保留最大酶活的20-40%。在最适酶活温度和原位环境温度下,当压力升高至原位压力时,MpTmm对底物TMA的酶活性约为大气压下酶活性的75%;而当压力继续升高至50MPa时,MpTmm对底物TMA的酶活性约为大气压下酶活性的50%。说明MpTmm蛋白具有低温和高压适应性,D25菌株可以在深海原位环境下利用MpTmm氧化TMA积累TMAO,行使耐压的功能。四、TmaT蛋白和MpTmm蛋白在Escherichia coli DH5α菌株中的功能验证由于D25菌株难以进行遗传操作,用DH5α菌株验证了 TmaT蛋白和MpTmm蛋白在细胞内的功能。结果表明,在DH5α菌株中表达TmaT蛋白使DH5α菌株具有了转运TMA的功能;在DH5α菌株中同时表达TmaT蛋白和MpTmm蛋白使DH5α菌株能吸收TMA并在胞内积累TMAO。表明在DH5α细胞内TmaT蛋白具有转运TMA的能力,MpTmm具有催化TMA氧化的功能。进一步分析了在培养基中添加TMA时共表达TmaT蛋白和MpTmm蛋白的DH5α菌株在高压环境下的生长和生存。当培养基中添加TMA时,同时表达Mptmm基因和tmaT基因的DH5α菌株在20 MPa和40 MPa条件下的生长速度快于其他组,说明Mptmm基因和tmaT基因共同表达促进了 DH5α菌株在高压环境下的生长。在培养基中添加TMA也会减轻高压对共表达TmaT蛋白和MpTmm蛋白的DH5α菌株形态和分裂的影响:在20 MPa压力下,DH5α菌株形态和分裂基本不受影响,在40 MPa压力下,DH5α菌株仍然可以保持细胞的完整性。这些结果表明,在TMA存在时,TmaT蛋白和MpTmm蛋白的共表达能提高DH5α菌株对高压的耐受性。因此在DH5α菌株细胞内证明了 TmaT蛋白和MpTmm蛋白在细菌高压适应中的功能。五、TmaT和MpTmm同源蛋白在拟杆菌门中的分布通过对IMG/JGI数据库和TARA ocean数据库中拟杆菌门基因组分析发现,TmaT同源蛋白在拟杆菌门中广泛分布。TmaT同源蛋白与甜菜碱转运蛋白（BetP）、肉毒碱转运蛋白（CaiT）和胆碱转运蛋白（BetT）独立成簇,在BCCT家族形成第四个分支。对IMG/JGI数据库中99株来源于深海和沉积物的拟杆菌门细菌基因组进行分析。发现具有编码TmaT同源蛋白基因或者MpTmm同源蛋白基因的细菌共有74株。其中具有编码两种同源蛋白基因的细菌有18株,分布于Cytophagia、Flavobacteriia、Sphingobacteriia和Saprospiria 四个纲中。与D25菌株一致,在培养基中添加TMA后可以促进Cytophaga sp.I-545-C菌株、Aquimarina litoralis CNURIC011 菌株、Zunongwangia profundi SM-A87菌株和Euzebyella algicola MEBiC 12267菌株在30 MPa高压环境下的生存和生长,表明D25菌株利用TMAO耐压的策略可能被其它海洋拟杆菌门细菌采用。TMA在深海海域含量丰富,最高可达50 mM,因此由TmaT和MpTmm同源蛋白参与的TMA代谢为深海拟杆菌门提供了一个简单而经济的适应高静水压的方式。