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目的:本研究中,我们复制了用葡聚糖硫酸钠盐法(Dextran Sulfate Sodium,DSS)在实验室条件下诱导小鼠而建立的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型,探求姜黄素在溃疡性结肠炎治疗中发挥的作用及其作用机制,通过测定小鼠结肠组织中信号通路相关蛋白的表达和调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)亚型与亚群的比率以及对调节性B细胞相关的细胞因子表达水平的影响,进一步探究姜黄素通过Bcl-6信号通路相关蛋白的表达调控调节性B细胞和细胞因子来缓解小鼠溃疡性结肠炎的可能机制。方法:(1)实验动物分组、复制DSS溃疡性结肠炎小鼠模型和给药方法:随机选用40只健康SPF级Ba Lb/c雄性小鼠,按规定的条件适应性喂养5日后进行本实验。小鼠随机被均分为四组(每组10只):空白对照组,空白+姜黄素组,溃疡性结肠炎模型+姜黄素组,溃疡性结肠炎模型组。空白对照组与空白+姜黄素组小鼠每日自由饮用正常饮用水,溃疡性结肠炎模型组与溃疡性结肠炎模型+姜黄素组小鼠均给予3%(w/v)DSS(35000-50000 Da)溶液自由饮用,连续十天。此后对空白+姜黄素组与溃疡性结肠炎模型+姜黄素组灌胃200 mg/kg姜黄素混悬液;溃疡性结肠炎模型组和空白对照组以灌胃方式给予等量的生理盐水,连续十二天。(2)姜黄素治疗由DSS诱导的溃疡性结肠炎疗效评价:实验期间每天观察每组小鼠毛发光亮润泽度、活动情况、食量大小情况、是否有腹泻及粪便潜血等体质和习性变化。每天记录实验期间每组小鼠体重变化、粪便粘稠度、粪便潜血变化情况。第二十三天,小鼠禁食不禁水维持12小时,称量小鼠体重后,腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.14 m L/kg)麻醉小鼠,经由眼球取血后,颈椎脱臼处死小鼠并迅速打开小鼠腹腔,解剖分离小鼠脾脏,并取出小鼠肛门以上一厘米至回盲部上端处,即小鼠结肠,在冰上放松平铺结肠并测量结肠段长度,测量结肠长度并拍照存档。记录并计算结肠质量和长度、体质量指数、脾脏质量和单位长度结肠质量。后用小鼠0.4-0.6厘米结肠组织处理后做成结肠组织病理切片后进行H&E染色,观察并进行疾病活跃指数评分(Disease Activity Index,DAI score)和病理损伤评分(Pathological damage score)。(3)姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中细胞因子表达的影响:用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)测定实验小鼠结肠组织中相关细胞因子IL-1β,IL-6,IL-10,IL-17A,IL-35和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)的含量,探索姜黄素调控细胞因子的分泌及其缓解溃疡性结肠炎炎症的机制。(4)调节性B细胞亚型亚群的比例分析:用流式细胞仪对调节性B细胞亚型FCRL5+Breg,Ig G+Breg,Ig M+Breg,CD103+Breg,Ig A+Breg,IL-10+Breg,CD103+Breg,Fas L+Breg,PD-1+Breg细胞比例进行测定,进一步推测姜黄素是否通过调控调节性B细胞亚型的分化从而对溃疡性结肠炎产生治疗功能作用。(5)姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠Bcl-6信号通路相关蛋白表达的影响:用蛋白质免疫印迹法(Western Blot Assy)对Bcl-6、CIN85、Syk、P-Syk、BLNK、P-BLNK含量进行检测,探究姜黄素对于溃疡性结肠炎小鼠Bcl-6信号通路的影响。(6)运用软件SPSS 25.0和Graph Pad Prism 9.0进行统计学检验与分析:每组小鼠的数据均检验是否符合正态分布和独立样本t检验,分析方差是否齐性,用直线回归表达相关关系。计量资料均以均数±标准差((?)±s)表示。组间对比采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD检验,P<0.05时表明差异有显著性,P<0.01时表明差异极具有显著性。结果:一、姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠疗效评价:与空白对照组相比,DSS组小鼠在给药第八天开始体重出现下降,体质量增长率开始降低,同时观察到该组小鼠与其他组相比的出现行动缓慢、进食量减少及活跃度差的体征。到第十天,小鼠体质量和体重增长率均达到最低点,到第十天该组小鼠大部分出现不成形稀便和血便,毛发暗淡,弓背、神情呆滞等体征。经姜黄素给药干预组的体重相比DSS组明显恢复,体质量增长率出现下降趋势后立即恢复,小鼠的进食量增加,行动恢复迅速,便血和稀便情况好转,活跃度增加。说明姜黄素能有效减轻DSS诱导的结肠炎。空白+姜黄素组与空白对照组各项指标趋势几乎一致。处死当天与DSS组相比较,空白对照组、空白+姜黄素组和DSS+姜黄素组体质量和体重增长率均高于DSS组,说明姜黄素有预防溃疡性结肠炎的作用。根据实验后各组小鼠的DAI评分,经DSS实验室诱导后,DSS组小鼠DAI评分较空白对照组显著上升,提示模型复制成功,经Cur给药干预后,DSS+Cur组体质量有所恢复,DAI指数下降(P<0.05,P<0.01),同样说明姜黄素有预防溃疡性结肠炎的作用。处死小鼠后对各组小鼠数据进行比较,与空白对照组相比,DSS组小鼠体质量、结肠长度显著下降(P<0.05,P<0.01),给予姜黄素治疗后的DSS小鼠与未经治疗的DSS小鼠相比,体质量、结肠长度显著上升(P<0.05)。DSS组小鼠与空白对照组相比,体重指数、结肠质量、脾脏质量、单位长度结肠质量均有上升趋势(P<0.05,P<0.01),而经姜黄素给药治疗后与DSS组相比,体重指数、结肠质量、脾脏质量、单位长度结肠质量上升趋势均明显降低(P<0.05,P<0.01),空白对照组小鼠结肠组织结构正常,肠黏膜、隐窝和杯状细胞均完整,腺体规律排列,无炎性细胞和溃疡细胞浸润。与空白对照组相比,DSS组小鼠的结肠出现黏膜结构缺损,杯状细胞残缺,隐窝缺失不全,腺体排列紊乱或缺失,血管则现大量增生,有大面积溃疡和炎性细胞浸润且延伸至黏膜下层,组织充血肿胀,病理学评分显著升高(P<0.01)。经姜黄素治疗后,相对DSS组,结肠溃疡、糜烂面积变少,血管增生程度变小,腺体排列更有序,隐窝和杯状细修复,炎细胞浸润得到改善,病理学评分显著降低,提示姜黄素可以有效缓解由DSS诱导的实验性溃疡性结肠炎。二、姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠调节性B细胞分化相关细胞因子的影响:用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测结肠组织相关细胞因子,将DSS组与空白对照组相比较,DSS组白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),白细胞介素-17A(Interleukin-17A,IL-17A)和TNF-α表达量显著增加(P<0.01),而白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)和白细胞介素-35(Interleukin-35,IL-35)表达量显著降低(P<0.01)。经Cur治疗干预后与DSS组相比较,结肠中IL-1β,IL-17A和TNF-α表达量显著降低(P<0.01),IL-6表达量与DSS组没有显著差异,而IL-10和IL-35表达量显著增加(P<0.01),与空白对照组趋于一致,表明姜黄素能够有效抑制IL-1β,IL-17A和TNF-α等致炎症细胞因子的表达,可以促进IL-10和IL-35等抑炎症细胞因子的表达。三、姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠调节性B细胞分化的调控:通过CD19+CD27+设门,对作为Breg细胞进行标记筛选。与空白对照组相比较DSS组FCRL5+Breg,CD103+Breg,Ig A+Breg,IL-10+Breg,PD-1+Breg,CD38+Breg和Tim-3+Breg细胞比率下降(P<0.01);与DSS组相比较,姜黄素给药治疗后中上述细胞比率显著升高(P<0.01)。而与空白对照组相比,DSS组Ig G+Breg,Ig M+Breg,Fas L+Breg和CXCR3+Breg细胞比率明显升高(P<0.01),经过姜黄素治疗后与DSS组相比,Ig G+Breg,Ig M+Breg,Fas L+Breg和CXCR3+Breg细胞比率明显降低(P<0.01),表明姜黄素可有效调控溃疡性结肠炎小鼠Breg细胞的分化。与空白对照组相比,空白+姜黄素FCRL5+Breg的细胞比率显著升高(P<0.01),CD103+Breg,PD-1+Breg和Tim-3+Breg的细胞比率显著降低(P<0.01)。Ig G+Breg,Ig M+Breg,Ig A+Breg和IL-10+Breg有明显上升(P<0.05,P<0.01),CD38+Breg,Fas L+Breg和CXCR3+Breg显著下降(P<0.05,P<0.01)。因此姜黄素能够有效调控由DSS诱导的实验条件下溃疡性结肠炎小鼠Breg细胞平衡与分化后亚型的表达。四、姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠信号通路相关蛋白表达的影响:用蛋白印迹法对相关信号通路蛋白Bcl-6、CIN85、Syk、P-Syk、BLNK、P-BLNK进行检测,与空白对照组相比较:DSS组的Bcl-6,CIN85,Syk和P-Syk的表达量明显上升(P<0.01,P<0.05),BLNK和P-BLNK的表达量明显下降(P<0.01)。经Cur治疗干预后与DSS组相比较Bcl-6,CIN85,Syk和P-Syk的表达量明显下降(P<0.01,P<0.05),BLNK和P-BLNK的表达量明显上升(P<0.05)。提示姜黄素可以有效影响溃疡性结肠炎小鼠信号通路相关蛋白的表达。结论:姜黄素能够有效治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎,可能是通过调节Bcl-6相关信号通路蛋白以调控Breg细胞活化实现的。