成体骨骼肌C-met~+与Pax7~+细胞池的研究

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前沿:骨骼肌的损伤修复是当今研究的热点和前沿,实施干细胞治疗是解决骨骼肌损伤、衰老问题的关键所在。本文分别对成体骨骼肌C-met~+及Pax~+细胞不同群进行分离,并对其形态、增殖与分化进行了初步研究,为将来对损伤、衰老骨骼肌实施干细胞治疗打下基础。方法与结果:(1)在先前研究的基础上,本论文研究采用酶消化-多步时间-抗体磁珠法分别从成年大鼠趾长伸肌(EDL;快肌)和比目鱼肌(SOL;慢肌)中分离出C-met~+及Pax7~+细胞不同群。体外培养结果发现:C-met~+及Pax7~+细胞形态原代多为长梭形,传代后第2代后多为不规则多角形。EDL C-met~+及Pax7~+细胞呈扁平而薄的多角形,SOL C-met~+及Pax7~+细胞呈细长多角形。(2)使用PT-PCR和荧光免疫组化测定C-met~+及Pax7~+细胞的骨骼肌相应标记物及CD分子,发现:EDL C-met~+细胞均表达TnIfast,SOL C-met~+细胞表达TnIslow及TnIfast;C-met~+及Pax7~+细胞表达ICAM、CD102、CD13;Pax7~+细胞不表达成肌调节因子MyoD系列;C-met~+细胞MF-20免疫荧光染色呈阴性。该二部分结果提示:经分离的C-met~+及Pax7~+细胞群可能是各不相同的群。(3)使用MTT和流式细胞法测定C-met~+及Pax7~+细胞不同群的生长曲线和细胞周期分布等参数,发现C-met~+及Pax7~+细胞不同群72小时进入指数生长期,其倍增时间约为24-33小时。源自快肌C-met~+及Pax7~+细胞生长速度快于源自慢肌的C-met~+及Pax7~+细胞,且Pax7~+细胞较C-met~+细胞生长速度快;C-met~+细胞EDL-down’第6代和SOL-up’第8代呈β-galactosidase阳性,而SOL-down第7代呈β-galactosidase阴性;上述结果提示:快肌与慢肌C-met~+及Pax7~+细胞的数目和亚群很有可能不尽相同,慢肌C-met~+及Pax7~+细胞生长速度较快肌的快,且无论源自快肌与慢肌,Pax7~+细胞较C-met~+细胞增殖潜能大。(4)使用胎鼠肌肉和大脑蛋白抽提液及5-氮胞苷对EDL和SOL C-met~+及Pax7~+细胞EDL-up、SOL-up、SOL-down’进行诱导,可见类肌管结构。RT-PCR结果表明:只有SOL-down’组的Pax7~+细胞表达Myf5;别的组经诱导后不表达成肌调节因子;5-氮胞苷诱导后的C-met~+细胞EDL-up组及Pax7~+细胞SOL-up组表达特异性心肌标记物GATA4和Mef-2c;体内研究表明:SOL-up组C-met~+细胞呈MF-20阳性,提示:C-met~+及Pax7~+细胞EDL-up、SOL-up、SOL-down’具有一定的成肌分化能力和向心肌分化能力。结论:(1)经分离C-met~+及Pax7~+细胞不同群绝大部分均能连续传代(除C-met~+细胞EDL-down),但传代能力有限,且具有一定的成肌分化及心肌分化能力(如EDL-up、SOL-up、SOL-down’),因此相应群具有成体干细胞的特性;(2)慢肌C-met~+及Pax7~+干细胞亚群的生长速度及增殖能力大于快肌C-met~+及Pax7~+干细胞亚群;(3)快肌和慢肌C-met~+细胞及快肌和慢肌Pax7~+细胞存在亚群;快肌较之于慢肌其C-met~+细胞池和Pax7~+细胞池不尽相同,快肌与慢肌很有可能分别有特异于其肌纤维类型的干细胞亚群。
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