对于急性心肌梗死病人来说,早期而又有效的实施缺血心肌的再灌注是减少梗死面积和提高临床转归的最有效的方法。但是,缺血心肌的血流的重新供应矛盾地导致心肌的损伤。这种现象称为缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury, I/R)。I/R是多因素、多机制相互作用、相互发展的结果,其中主要的病理机制包括氧化应激反应、自由基损伤、细胞凋亡和细胞内或线粒体内钙超载等。目前,缺血再灌注损伤的防治措施主要包括方法和药物两方面。缺血预适应(ischemia preconditioning, IPC)和缺血后适应(ischemia postconditioning, IPO)都是减少再灌注损伤的有效措施,只是处理的时程不同而已。药物处理也是同理。钙超载是I/R的重要作用因素,多种钙离子通道参与其中,那么,钙离子拮抗剂的作用及其可能的作用机制就值得关注。内皮素-1 (Endothelin-1,ET-1)是由内皮细胞产生的21氨基酸肽,具有强有力的血管收缩作用,主要通过激活ETA型和ETB型受体发挥生物效应。研究发现,在急性心肌梗死以及对其进行即刻的血管成形术进行治疗后,均发现存在血浆中ET-1含量升高的现象。这表明ET-1在缺血再灌注的发生发展过程中起着重要作用。但是,一直以来,ET-1在缺血再灌注损伤中的具体作用却存在着争议。有关ET-1有助于梗死的发展以及减少梗死面积的报道都有出现。可见,实验方案和实验条件的不同影响ET-1的作用。而不同浓度的ET-1产生的影响是否相同报道很少。在细胞外存在钙离子的情况下,内皮素-1产生的动脉环的收缩作用具有剂量依赖性。如果能够阻断ET-1产生的强烈收缩血管作用,而同时保留ET-1的维持血管张力作用,将极大改善缺血再灌注损伤所带来的危害。新型钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908激活不同的钙离子通道,对不同浓度的ET-1起着不同的抑制作用。研究发现在大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),低浓度的ET-1引起的平滑肌收缩能够被钙离子拮抗剂LOE908或SK&F96365所阻断,而高浓度的ET-1所引起的收缩能被LOE908或SK&F96365减弱,但是不能被完全阻断,如联合使用LOE908和SK&F96365则可完全阻断收缩。可见,阻断ET-1产生的强烈收缩血管作用,而同时保留ET-1维持正常血管张力的作用是可行的。基于以上认识,采用离体Langendorff灌注模型和在体心脏缺血再灌注模型,对钙离子拮抗剂SK&F96365、LOE908和ET-1进行综合研究。观察不同浓度ET-1对于I/R的影响以及可能的相关机制；钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对于ET-1的影响以及是否产生心肌保护作用。第一章ET-1对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用目的本研究将通过建立Langendorff离体心脏灌注模型,并在此模型的基础上研究不同浓度的ET-1对于心脏的不同作用及其可能的相关机制,再进一步探讨SK&F96365和LOE908对于ET-1的影响以及对心脏的保护作用。材料与方法1.实验动物本研究选用体重180-220g的雄性SD大鼠,购于中山大学实验动物中心。实验动物的使用及处理方法,严格按照广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求进行,并尽可能减少动物的使用数量。2.动物Langendorff模型的制备及分组将离体大鼠心脏悬于Langendorff灌注装置,以恒压恒温的方式进行逆灌。停止K-H灌注液的灌注即为全心缺血,然后再恢复灌注。大鼠随机分为五组：1)缺血再灌注(I/R)组：用K-H液心脏灌注30min,然后停止灌注液造成全心缺血30min,再恢复灌注60min。2)ET-1预处理组：在I/R组的基础上,在缺血一开始,分别单次注射ET-10.1nM, 1nM, 10nM。3) BQ123处理组(BQ123组)：在ET-11 nM组的基础上,在注射ET-1的前5 min开始持续灌注2μMBQ-123。4) SK&F96365处理组：在ET-1 10 nM组的基础上,在注射ET-1的前5 min开始持续灌注30μM SK&F96365。5) LOE908处理组(LOE908组)：在ET-1 10 nM组的基础上,在注射ET-1的前5 min开始持续灌注30μMLOE908。3.各项指标的观察应用PcLab-UE生物医学信号采集处理系统实时观察分析并且记录灌注10min、30min以及再灌注后5 min,10 min,30 min和60 min各个时刻的左室最大心室压、左室最小心室压、左室舒张末压(LVEDP)以及心率。测定各个时点一分钟内的冠脉流量(CF)。收集恢复灌注后5min的冠脉流出液,检测其中的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量。对再灌注结束的大鼠心脏,留取左心室进行HE染色并进行观察。4.统计学方法采用SPSS13.0软件进行分析,所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示。组间均数多重比较应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐则采用LSD方法,不齐则采用Dunntt-T3方法。两组间均数比较采用独立样本t检验分析。重复测量数据的均数比较采用重复测量方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.不同浓度ET-1对于离体心脏功能的不同影响0.1nM和1 nM ET-1明显改善了心功能,表现为LVDP明显升高(93.89±21.84,80.35±8.62mmHg), LVEDP显著下降(8.05±2.64,16.17±7.09mmHg),有统计学意义(P<0.05)。心肌酶LDH和CK的含量显著降低(P=0.000和0.004,P=0.000和0.007),有统计学意义(P<0.05)。组织病理学检查显示损伤减轻。然而10nM ET-1在CF方面(4.33±1.03 ml/min)有着显著下降(P<0.05),显示其强有力的收缩作用,不利于心肌的保护。2.ETA受体在ET-1心肌保护中的作用BQ-123抑制了ET-1的保护作用,使得LVDP明显降低(26.22±6.78 mmHg),而LVEDP显著升高(14.80±3.87 mmHg),心功能减弱,有统计学意义(P<0.05)。LDH和CK的含量显著增加(P=0.032和0.023),有统计学意义(P<0.05)。组织病理学检查显示损伤加重。可见ETA受体可能参与其中。3.SK&F96365和LOE908对于ET-1在心肌的影响SK&F96365和LOE908明显改善了心功能,LVDP明显升高(82.08±17.28,70.58±7.45mmHg),LVEDP显著下降(9.50±3.43,和11.34±3.69 mmHg),CF明显增加(8.17±0.75、7.50±1.38 ml/min),有统计学意义(P<0.05)。心肌酶LDH和CK的含量显著降低(P=0.000和0.012,P=0.000和0.021)。组织病理学检查显示损伤减轻。SK&F96365和LOE908对于10 nM ET-1的血管收缩作用有一定的抑制作用,起到增强其心肌的保护作用。第二章SK&F96365和LOE908对在体心脏缺血再灌注损伤的保护作用目的本研究将通过建立在体心脏缺血再灌注模型,并在此模型的基础上研究SK&F96365和LOE908对于ET-1的影响以及对心脏的保护作用。材料与方法1.实验动物本研究选用体重180-220g的雄性SD大鼠,购于中山大学实验动物中心。实验动物的使用及处理方法,严格按照广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求进行,并尽可能减少动物的使用数量。2.动物在体缺血再灌模型的制备及分组大鼠经由气管内插管进行辅助呼吸。采用左侧开胸术暴露心脏,对左侧冠状动脉前降支进行结扎造成缺血,然后松开结扎恢复血流灌注。大鼠随机分为四组：1)假性手术组：心脏适应10min后,5-0丝线仅仅是穿过左冠脉前降支并没有缝扎30min,然后去掉丝线,总体时间100min。2)缺血再灌注(I/R)组：心脏适应10min后,5-0丝线缝扎左冠脉前降支30min,然后松开丝线再恢复灌注60min。3) SK&F96365处理组：在I/R组的基础上,在恢复灌注的即刻静脉注射0.06mg/kg SK&F96365。4) LOE908处理组(LOE908组)：在I/R组的基础上,在恢复灌注的即刻静脉注射0.1mg/kg LOE908。　3.各项指标的观察实验结束后,留取大鼠颈动脉血液,检测其中的乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及内皮素-1(ET-1)的含量。对再灌注结束的大鼠心脏,进行TTC染色测定其中的梗死面积。4.统计学方法采用SPSS 13.0软件进行分析,所有数据均采用均数±标准差表示,组间均数比较应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐则采用LSD方法,不齐则采用Dunntt-T3方法。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对心肌组织酶学指标的影响大鼠心脏缺血再灌注后LDH (1356.33±186.75 U/L)和CK-MB (651.00± 58.07 U/L)均显著性的增高(P=0.000),表明模型成功。运用SK&F96365和LOE908后,与I/R组相比,LDH(1077.00±119.26 U/L和1070.17±105.84 U/L)和CK-MB (529.00±51.80 U/L和517.50±112.95 U/L)均显著降低(P=0.004和0.003),有统计学意义。2.钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908对血浆中内皮素-1浓度的影响大鼠心脏缺血再灌注后,ET-1的含量(74.97±6.64 pg/ml)显著增高(P=0.000)。而使用SK&F96365和LOE908后,ET-1的含量(57.88±6.54 pg/ml和62.85±6.03 pg/ml)均有着不同程度的降低,并且均有统计学意义(P=0.000和0.002)。可见SK&F96365和LOE908对ET-1有着抑制作用。3.大鼠心脏梗死面积的变化大鼠心脏缺血再灌注的措施增加了心肌的梗死面积(48.00±2.60%),具有统计学意义(P=0.000)。运用SK&F96365(29.03±3.15%)和LOE908(30.80±2.83%)后,梗死面积有着显著降低(P=0.000)。这和心肌酶学指标的结果基本一致。全文结论1.不同浓度的内皮素-1对于缺血再灌注损伤模型的心肌有着不同的作用：低浓度内皮素-1有着显著的保护作用,而高浓度内皮素-1所表现的强烈收缩血管的作用,对心肌产生一定的损伤。2.内皮素A受体可能参与内皮素-1的心肌保护作用机制。3.钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908均能抑制高浓度ET-1的强烈血管收缩作用以增强其产生的心肌保护作用。4.钙离子拮抗剂SK&F96365和LOE908具有心肌保护作用。