论文部分内容阅读
水分是影响作物生长发育的重要因素之一,而小麦是许多干旱和半干旱地区国家的主要栽培作物之一,全世界共同面临的水资源紧缺制约着小麦的生产,提高小麦的耐旱能力对于小麦增产及有效利用干旱、半干旱土地具有重要意义。为了挖掘和利用小麦水分高效利用的基因资源。本研究在建立陕229干旱复水诱导表达的SSH-cDNA文库的基础上,克隆了一个小麦在干旱及复水状态下特异表达的基因——小麦乙烯受体基因(ERS),同时采用实时荧光定量RT-PCR对其在干旱胁迫和复水条件下的表达模式进行了分析。并以水分胁迫和复水条件下SAMS基因在小麦叶片中的表达分析为例,比较分析了半定量RT-PCR技术和Real-time RT-PCR技术检测了在检测基因表达的特异性和灵敏度的差异。得到的主要结果如下:1.在以小麦主栽品种陕229的干旱和干旱后复水小麦幼苗叶片为材料,利用抑制消减杂交技术,建立的陕229的干旱复水诱导表达的SSH-cDNA文库的基础上,从消减文库中随机挑选阳性克隆59个并测序,去除冗余序列和嵌合序列后,进行同源性比对和功能分析。获得高质量EST序列32条,有25条EST可以找到同源性较高的EST序列,部分序列相关于植物的非生物胁迫,一部分序列未能获得信息。序列分析表明:13条EST序列相似于已知蛋白,它们涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控及防卫反应等方面。2.根据已知水稻乙烯受体基因的序列信息,设计了两对引物对小麦叶片cDNA进行扩增,获得了一个小麦乙烯受体基因(TaERS)的片段。序列分析表明,该片段大小为1475bp,编码485个氨基酸。对推测蛋白的结构分析显示TaERS编码的蛋白与水稻、玉米ERS所编码的蛋白同源性较高,具有GAF结构,HisKA结构和HATPase_c等保守结构功能域,表明TaERS基因属于ERS1基因。基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明,不同植物的ERS基因遗传分化很大,序列相似性为52%～100%,其中小麦ERS基因与水稻的ERS相似程度最高(100 %),与烟草的相似性最低。通过实时荧光定量RT-PCR对其表达模式分析表明,该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达,与小麦抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。3.以tublin为内参基因,以本实验室克隆的普通小麦S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的序列分别设计引物,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法,对陕229小麦叶片中SAMS基因在正常供水及PEG6000模拟水分胁迫24、36、48、60、78h以及复水3、6、18h时的表达模式进行分析。结果表明,两种PCR法中SAMS的表达量均受干旱和复水的诱导。小麦SAMS基因在正常生长情况下有一定量的表达,在干旱胁迫早期(PEG6000胁迫24、36、48h)诱导上调表达,干旱胁迫程度严重时(PEG6000胁迫60、78h)表达受到抑制,复水后两种方法检测表现出差异。以上结果表明小麦SAMS基因的表达受干旱胁迫及干旱后复水诱导,是小麦抗旱节水的关键基因,而Real-time RT-PCR的定量结果更为可靠、更为灵敏。