类风湿性关节炎(RA)是一种以滑膜炎症,软骨侵蚀和关节破坏为主要特征的慢性免疫性综合征,目前RA的治疗取得较大进步,通过一线非甾体抗炎药联合抗风湿药控制病情,虽然炎症部分已得到成功控制,但仍不能阻止RA的病情进展,疗效也还不尽人意,因此积极寻找保护软骨免受破坏和关节免受损伤的药物成为广大国内外学者的共同期待。流行病学统计发现雌激素的缺乏和代谢与类风湿性关节炎的发生和发展紧密相关。雌激素保护关节软骨损伤,在摘除卵巢的RA大鼠中,雌二醇替代疗法能够缓解局部炎症和膝关节软骨损伤。但雌二醇如何影响RA的发病进程和其发挥保护作用的机制并不清楚;酸敏感离子通道,是一类阳离子通道,在酸诱导的软骨细胞的损伤中扮演着重要的角色。前期本课题组的大量研究发现降低ASIC1a的表达和活性能明显削弱酸诱导的软骨细胞的损伤。本实验的主要目的是通过体外实验去探索雌二醇在酸诱导的大鼠关节软骨细胞损伤的作用和阐明雌二醇对ASIC1a活性和蛋白表达的影响及其可能机制;本文雌二醇均指17β-雌二醇;本课题主要包括以下:1.雌二醇对酸诱导的大鼠关节软骨损伤的作用体外实验中探索雌二醇在正常状况下对大鼠关节软骨细胞增长率的影响及在酸诱导病理条件下对软骨细胞生存率,细胞形态学改变和线粒体膜电位的变化。将正常大鼠关节软骨细胞分为正常组,500,1000,2000n M雌二醇组,雌二醇处理48小时后,MTT检测雌二醇对大鼠关节软骨细胞的存活率没有统计学意义;进一步探索雌二醇对酸诱导的大鼠关节软骨细胞存活率的影响,将原代细胞按以下分组:(1)正常组,p H6.0,p H6.0+500/1000/2000n M雌二醇组,雌二醇刺激48h后,p H6.0酸化培养基环境下处理3h,使用MTT来探索细胞的存活量;(2)正常组,p H6.0,p H6.0+雌二醇,p H6.0+ICI,p H6.0+ICI+雌二醇,雌激素受体(ERs)阻断剂ICI,雌二醇预处理后,p H6.0环境下刺激3h,细胞存活量通过MTT法来检测;(3)正常组,p H6.0,p H6.0+雌二醇,p H6.0+Pc TX1,p H6.0+Pc TX1+雌二醇组;ASIC1a特异性阻断剂Pc TX1和雌二醇预处理后,p H6.0环境下刺激3h后,MTT检测了细胞生存率。在p H6.0的条件下,雌二醇能够明显缓解酸诱导的软骨细胞的生存率;ICI187280,作为ERs阻断剂,它的预处理反转了雌二醇介导的保护作用,这初步的说明了雌二醇能够降低酸诱导的软骨细胞损伤;分别使用雌二醇,Pc TX1预处理软骨细胞后,MTT检测到两者发挥相似的酸诱导的保护作用,但联合雌二醇及Pc TX1孵育后,雌二醇并不能进一步增加Pc TX1的保护作用,这说明了ASIC1a的激活可能参与雌二醇介导的软骨保护作用;再进一步的采用细胞形态学分析和罗丹明123(Rhodamine123)染色分析了雌二醇对酸介导的软骨保护,结果发现雌二醇能够明显改善酸化导致的软骨细胞形态的皱缩和线粒体完整性的破坏。总之,这些功能的检测均表明了雌二醇降低酸诱导的软骨损伤。2.雌二醇在大鼠关节软骨细胞中对ASIC1a蛋白表达和活性的影响采用不同浓度雌二醇处理大鼠关节软骨细胞72h后,Western blotting和Q-PCR分别检测ASIC1a蛋白和基因转录,并且确定了雌二醇降低ASIC1a蛋白表达的最佳浓度,以1000n M雌二醇分别刺激软骨细胞24,48,72h后,Western blotting和Q-PCR检验ASIC1a的蛋白和基因转录,以最佳浓度1000n M孵育72h后,免疫荧光法和激光共聚焦技术分别探索了雌二醇对ASIC1a蛋白表达和活性的影响。以上结果共同确定了雌二醇能够降低ASIC1a的蛋白表达和活性,而对ASIC1a的基因转录并没有影响。3.雌二醇降低ASIC1a的蛋白表达的机制联合蛋白合成酶抑制剂CHX和雌二醇联合孵育软骨细胞一定时间后,ASIC1a的蛋白表达较CHX组,明显降低,这初步的说明了雌二醇促进ASIC1a的蛋白降解;进一步的使用蛋白酶体抑制剂MG-312,钙蛋白酶抑制剂ALLN后,对雌二醇介导的ASIC1a的蛋白降低并没有影响,而使用溶酶体CQ和自噬抑制剂3-MA阻断自噬溶酶体途径后,能够明显翻转雌二醇诱导的ASIC1a蛋白降解,这进一步的说明了雌二醇通过自噬溶酶体途径促进ASIC1a的蛋白降解;同时,结果也表明了雌二醇增加了Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达,而CQ预处理后,雌二醇显著增加了Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达;免疫荧光也证明了雌二醇激活LC3的这一现象;这些结果说明了雌二醇激活自噬并且自噬溶酶体途径参与雌二醇介导的ASIC1a的蛋白降解过程;4.雌激素受体在雌二醇介导的ASIC1a蛋白降低中的作用将原代软骨细胞分为正常组,雌二醇,雌激素受体(ERs)阻断剂ICI,ICI+雌二醇组,Western blot检测ASIC1a的蛋白表达,结果表明了雌二醇对ASIC1a的降低作用被ICI阻断;采用雌激素受体ERα,ERβ,GPR30的特异性阻断剂MPP,PHTPP,G15预处理,雌二醇进一步的孵育,结果表明只有ERα阻断剂MPP产生了更显著的逆转作用。此外,si RNA沉默ERα后,显著提高了雌二醇介导的ASIC1a蛋白降低。这些结果表明,ERα而不是ERβ或GPR30参与雌二醇诱导的ASIC1a蛋白降解。5.雌二醇对酸化条件下大鼠关节软骨细胞凋亡的作用将正常离体软骨细胞分为Control,p H6.0,p H6.0+雌二醇组,p H6.0+Pc TX1组,四组经过一定的预处理后,流式细胞术和Hoechst染色分别检测了酸诱导的软骨细胞的凋亡率和细胞核的改变,为了进一步评估雌二醇对软骨细胞凋亡的影响,采用雌二醇预处理后,Western blot结果显示雌二醇能够降低酸诱导的Caspase-9和PARP的高表达,ERs阻滞剂1μM ICI预处理后反转了雌二醇这一作用;结果说明了雌二醇能够降低酸介导的软骨细胞的凋亡;ASIC1a的激活可能参与细胞的凋亡。我们发现Pc TX1,一种ASIC1a的特异性抑制剂,对细胞凋亡具有较好的抑制作用,表明ASIC1a激活与酸诱导的软骨细胞凋亡有关。为了进一步证实雌激素介导的保护作用与ASIC1a诱导的软骨细胞凋亡之间的关系,与Pc TX1相比,将Pc TX1和雌二醇联合共孵育后,Western blot结果显示雌二醇并不能进一步的增加Pc TX1降低ASIC1a,Caspase-9及PARP的水平,这些数据表明雌二醇通过ASIC1a通道的表达抑制酸诱导的软骨细胞凋亡。综上所述,这些结果表明雌二醇降低了ASIC1a水平,并负责酸介导的软骨细胞保护。初步实验结果表明雌二醇预处理后能够缓解大鼠关节软骨损伤,抑制凋亡和改善线粒体功能;进一步的研究发现,雌二醇通过自噬溶酶体途径降低ASIC1a蛋白表达,从而削弱酸诱导的大鼠关节软骨细胞损伤,并通过与雌激素受体ERα结合诱发ASIC1a蛋白降解。总之,这些结果表明雌二醇通过下调ASIC1a蛋白表达来减弱关节破坏,表明了雌二醇靶向ASIC1a有望成为治疗RA的有效靶点。