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裂头蚴病是一种被忽视的食源性寄生虫病,因感染迭宫属绦虫的幼虫(裂头蚴)而引起。蛙类作为迭宫属绦虫的第二中间宿主,在裂头蚴病的传播中起着重要作用。人因生食或半生食阳性蛙肉或使用生蛙肉敷贴伤口而感染。近年来,裂头蚴病的发病率在我国一些地区逐渐增加。目前,我国34个省/自治区/直辖市中,其中有26个地区有过裂头蚴病报道,累积病例超过1300例。然而对于全国范围内尤其是裂头蚴病流行区野生蛙体内裂头蚴的自然感染情况,尚缺乏全国范围的流行病学数据。此外,长期以来迭宫属绦虫的分类地位与物种鉴定一直存在争议,需要进一步研究。本研究分两个部分:第一部分首先对我国34个省/自治区/直辖市中的28个地区的145个采样点的野生蛙体内裂头蚴的自然感染情况进行了大地理尺度调查;对所获裂头蚴标本,采用多重PCR方法对不同地区的分离株进行鉴定,并对其进行聚类分析;接着,根据多重PCR及聚类分析结果,选取特异性裂头蚴分离株感染终宿主猫以获取成虫,然后,基于传统形态学方法对成虫进行鉴定,以明确我国裂头蚴分离株的分类学地位。第二部分,基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)基因,对我国127个不同裂头蚴地理株及Gen Bank数据库中全球范围的cox1序列,分别进行单倍型鉴定、遗传变异分析、单倍型网络分析、遗传结构分析、系统发育分析及种群扩张分析,对全球范围内迭宫绦虫的遗传多态性水平进行全面评估。材料与方法1.裂头蚴感染情况调查:2013年7月至2018年9月,本研究对我国34个省/自治区/直辖市中的28个地区的145个采样点的野生蛙进行裂头蚴自然感染情况调查。在稻田或其他野生环境中捕获野生蛙,首先对蛙类标本进行编号及物种鉴定,然后用乙醚麻醉,使其安乐死,称重并仔细观察蛙肌肉组织中是否有裂头蚴寄生,对于阳性蛙,分别对其体内裂头蚴寄生数量、寄生部位及感染强度进行统计,并测量虫体长度。2.多重PCR鉴定及聚类分析:基于4对特异性引物(Se/Sd-1800F+Se-2018R和Se/Sd-7955F+Se-8356R;Se/Sd-1800F+Sd-2317R和Se/Sd-7955F+Sd-8567R),对72个裂头蚴地理株进行多重PCR鉴定;同时根据PCR产物序列,分别采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和贝叶斯推断法(Bayesian Inference,BI)进行聚类分析。3.形态学鉴定:选用6月龄的雌性家猫作为终宿主,根据分子鉴定结果,选择河南郑州裂头蚴分离株作为代表,经口感染家猫,剂量为1条/只。采用改良加藤厚涂片法(Kato-Katz)计算迭宫绦虫每日排出虫卵量;感染后40天,从终宿主肠道内收集成虫:首先用PBS冲洗干净,并固定于AFA(85%乙醇+10%福尔马林+5%甘油)中,然后进行盐酸卡红染色。观察成节和孕节阴道口、子宫、子宫孔、生殖孔和睾丸等器官的形态特征,并将本研究获得的形态特征与其他迭宫绦虫物种:S.erinaceieuropaei(韩国分离株)、S.decipiens(南美洲分离株)和S.ranarum(缅甸分离株)进行比较,从而在形态学水平进行物种的比较鉴定。4.遗传多样性分析:利用公共数据库中全球范围内迭宫绦虫的cox1序列,并结合我国127个不同裂头蚴地理株,对迭宫绦虫的遗传多态性进行分析。利用MEGA软件进行序列比对、变异位点、核苷酸组成及遗传距离估算。使用Dna SP软件进行单倍型鉴定、单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分析。使用Network软件进行单倍型网络关系分析。利用Arlequin软件计算不同地理种群间的遗传差异水平。5.系统发育分析:分别采用最大似然法和贝叶斯推断法对所估算的cox1单倍型进行系统发育模式分析;最大似然法在MEGA软件进行,用Mr Bayes软件进行贝叶斯分析。使用Arlequin软件进行Tajima’s D和Fu’s F_S中性检验分析,根据中性检测结果推断迭宫绦虫种群是否发生过种群扩张;此外,利用BEAST软件进行贝叶斯扩张动力学分析,估计种群规模随时间推移所发生的变化。结果1.我国野生蛙体内裂头蚴感染情况:共收集野生蛙4665只,包括13个种,其中8种蛙类:黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)、金线侧褶蛙(Pelophylax plancyi)、泽陆蛙(Fejervarya limnocharis)、阔褶水蛙(Sylvirana latouchii)、沼蛙(Boulengerana guentheri)、棘胸蛙(Quasipaa spinosa)、绿臭蛙(Odorrana margaretae)、虎纹蛙(Hoplobatrachus chinensis),发现裂头蚴感染。总感染率为9.58%(447/4665),感染率最高的是黑斑蛙(14.07%),平均感染强度最高的也是黑斑蛙(4.27±3.02)。不同采样点蛙的感染率不同,总体范围为0～66.67%,感染强度范围为1～49条/只。此外,从裂头蚴的寄生部位来看,裂头蚴主要寄生于蛙大腿肌肉中(68.11%)。总的来说,华南和西南地区蛙的感染水平高于华中和华东地区。然而,东北地区没有发现阳性蛙。2.分子生物学鉴定:对我国72个不同地区的裂头蚴地理株的多重PCR鉴定结果显示2条特异性条带:540 bp和644 bp,进一步聚类分析提示我国裂头蚴分离株与欧猬迭宫绦虫(S.erinaceieuropaei)的亲缘关系较近;在拓扑结构树中,72个样本主要形成2个进化分支:分支1主要包括来自华南和西南地区的样本;分支2主要由华中和华东地区的样本组成。3.形态鉴定:感染后10天镜检发现虫卵,虫卵呈浅灰褐色,长50～65μm,宽30～45μm,虫卵排出量持续增加,至第19天达到平台期,平均每克粪便虫卵量为70,425个。成虫头节细小,具有较强伸缩能力;颈节位于头节之后;成节两侧可见明显排泄管,内部可见睾丸、子宫和卵巢;孕节中子宫发达,盘绕4～6圈,末端呈球形,可见3个孔状开口:阴茎孔、阴道孔和子宫孔,前2个孔组成生殖孔,位于中线前1/5处。通过与S.erinaceieuropaei、S.decipiens、和S.ranarum的形态学比较发现,我国的裂头蚴分离株与韩国的S.erinaceieuropaei在形态上更为相似。4.裂头蚴单倍型鉴定:全球488个迭宫绦虫分离株共鉴定出45个单倍型,具有较高的单倍型多样性(0.652±0.023),但核苷酸多样性较低(0.01619±0.00156)。单倍型网络分析表明,单倍型12(haplotype 12)为最显著的单倍型,样本涵盖中国、泰国、日本、澳大利亚、韩国和伊朗6个国家。遗传距离分析显示美洲(巴西、阿根廷、委内瑞拉和美国)、亚洲(中国、日本、韩国等)+澳大利亚、非洲(南苏丹和埃塞俄比亚)分离株之间的相互遗传差异较大(Fst>0.5)。5.系统发育分析:基于最大似然法和贝叶斯推断法的系统发育分析均显示全球迭宫属绦虫可分为4个主要世系:世系1(巴西、美国分离株);世系2(阿根廷、委内瑞拉分离株);世系3(南苏丹、埃塞俄比亚分离株);世系4(亚洲和澳大利亚类群),因此,来自美洲和非洲分类地位不明确的迭宫绦虫应被认为是独立种。此外,2个韩国分离株(S.erianceeuropaei KJ599680和S.decipeens KJ599679)的分类地位仍不明确,需要进一步鉴定。贝叶斯扩增动力学分析支持迭宫属绦虫出现过种群扩张。结论1我国华南和西南地区野生蛙体内裂头蚴的感染率仍然较高,因此食用野生蛙,尤其在烹饪方法不当的情况下,会带来较大的健康风险;2我国裂头蚴分离株属于欧猬迭宫绦虫(S.erinaceieuropaei);3韩国迭宫绦虫分离株S.decipiens(KJ599679)和S.erinaceieuropaei(KJ599680)的分类学地位仍存在争议;4全球范围内迭宫属绦虫具有较高的遗传多样性水平;5迭宫属绦虫可分为4个主要世系:世系1(巴西和美国类群);世系2(阿根廷和委内瑞拉类群);世系3(南苏丹和埃塞俄比亚类群)和世系4(亚洲和澳大利亚类群)。