论文部分内容阅读
传统中药赤芍具有活血化瘀的功效,成为治疗中风的配伍用药。天然产物芍药苷(Paeoniflorin,PF)是芍药根提取物中主要的单体成分,能够减轻脑缺血动物模型造成的神经损伤。本研究应用原代培养皮层神经元氧糖剥夺(OGD)模型模拟脑缺血再灌注造成的神经元损伤,MTT量化神经元的生存率。PF预处理能保护神经元,减轻OGD造成的神经损伤、提高生存率。PF在脑内具有浓度低、活性高的特点。提示PF具有神经营养因子样作用,介导其神经保护作用。 神经营养因子通常激活P13K/Akt和ERK1/2信号,促进神经元生长、增殖、存活、分化等。Akt和ERK1/2信号通路在缺血再灌注损伤研究中具有保护作用。本研究结果表明,OGD处理后的神经元的Akt和ERK1/2的磷酸化水平很低;PF能够上调再灌后Akt和ERK1/2磷酸化水平;MEK抑制剂U0126和PI3K抑制剂Wortmannin,都能够减弱PF对OGD处理后神经元的保护作用,提示MAPK/ERK和PI3K/Akt两条信号通路对神经元存活有重要作用。低浓度PF处理原代皮层神经元及稳转腺苷A1受体的HEK293细胞(HEK293/A1R),能够快速磷酸化Akt和ERK1/2,并且至少能维持一小时,免疫荧光图显示活化的ERK1/2核转位过程。 PF活化属于G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptor,GPCR)的腺苷A1受体,低浓度PF下调cAMP水平,此效应依赖Gi蛋白偶联的A1R活化。在未转染腺苷A1受体的HEK293细胞上未观察到PF对Akt和ERK1/2的活化;腺苷A1受体拮抗剂DPCPX,能够阻断PF对Akt和ERK1/2的磷酸化;将突变型腺苷A1受体转入HEK293细胞,PF对Akt和ERK1/2的磷酸化作用减弱,上述研究结果表明PF对Akt和ERK1/2的磷酸化依赖腺苷A1受体的完全活性。表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR),是一种受体酪氨酸激酶(Receptortyrosinekinase,RTK),属于神经营养因子受体超家族。在原代皮层神经元和HEK293/A1R细胞上,PF均可磷酸化EGFR(Tyr1068)。EGFR特异性抑制剂AG1478可抑制PF对Akt和ERK1/2的活化,表明PF对Akt和ERK1/2的激活依赖EGFR的酪氨酸激酶活性。DPCPX或AG1478分别阻断两个受体的作用,就能阻断PF对皮层神经元保护作用。 PF活化腺苷A1受体继而活化EGFR的现象即受体转移激活。免疫荧光结果显示在HEK293/A1R细胞上,PF可以增加腺苷A1受体和EGFR在细胞膜表面的共定位,免疫共沉淀实验表明PF增强腺苷A1受体和EGFR之间相互作用。Src激酶和MMP2都参与了PF对下游信号通路的激活。Src激酶抑制剂PP2抑制了PF对Akt和ERK1/2的活化。研究发现PF促使Src激酶磷酸化,并能被AG1478抑制;而Src激酶还能活化EGFR(Tyr845),因此Src激酶在PF激活Akt和ERK1/2信号通路中具有重要作用。BiPs是基质金属蛋白酶MMP2/MMP9的抑制剂,能够抑制ERK1/2的磷酸化,PF激活ERK1/2信号同时发现MMP2活性增强。上述结果提示PF激活腺苷A1受体转移激活EGFR过程中,MMP2和Src激酶可能分别通过配体依赖和非配体依赖的途径激活了EGFR,从而激活下游信号通路。应用PP2和BiPs分别抑制Src激酶和MMP2/9活性,就能抑制PF的神经保护作用,并且Src激酶作用更重要。 PF对Akt和ERK1/2信号通路的活化可能与抑制凋亡信号相关。免疫组化结果显示MCAO大鼠皮层区域缺血侧较对侧Bc1-2表达减少;PF能够提高OGD处理过神经元的Bc1-2含量。 本研究发现PF通过激活Akt和ERK1/2信号通路,发挥神经营养因子样作用。在原代皮层神经元和HEK293/A1R细胞上,PF激活下游Akt和ERK1/2信号通路,并依赖腺苷A1受体转移激活EGFR,介导其抗缺氧缺糖的神经保护作用。通过对PF的机制研究,为抗脑缺血及相关疾病的神经保护药物的研发提供了新的思路。