【摘 要】
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鸡脂肪肝出血综合征（FLHS）是鸡肝和腹腔内异位脂肪沉积过多,伴随肝组织质脆和出血为特征的营养代谢性疾病,病鸡在临床上表现为突然发病、肝破裂、出血和突然死亡等特征。骨钙素（OCN）是一种成骨细胞合成和分泌的特异性骨源性激素。本实验室前期研究发现,OCN减少高脂日粮诱导蛋鸡肝脏出血点和炎性反应,缓解胰岛素抵抗和氧化应激;且OCN可抑制肝脏JNK的磷酸化,降低p-JNK/JNK比值。然而OCN调控鸡F
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31702307）； 重庆市研究生科研创新项目（CYS20126）；
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鸡脂肪肝出血综合征（FLHS）是鸡肝和腹腔内异位脂肪沉积过多,伴随肝组织质脆和出血为特征的营养代谢性疾病,病鸡在临床上表现为突然发病、肝破裂、出血和突然死亡等特征。骨钙素（OCN）是一种成骨细胞合成和分泌的特异性骨源性激素。本实验室前期研究发现,OCN减少高脂日粮诱导蛋鸡肝脏出血点和炎性反应,缓解胰岛素抵抗和氧化应激;且OCN可抑制肝脏JNK的磷酸化,降低p-JNK/JNK比值。然而OCN调控鸡FLHS过程中的作用机制尚不清楚。因此,本试验构建脂肪乳诱导鸡胚脂肪化肝细胞模型,通过体外实验研究OCN对肝细胞脂肪化和损伤的影响及其机制。从15日龄鸡胚中分离获得鸡胚原代肝细胞,10%脂肪乳（FE）诱导肝细胞脂肪化,用0、3和9 ng/m L OCN处理细胞,研究OCN对脂肪化肝细胞的影响。并使用AdipoRon（脂联素受体激动剂）、NAC（ROS清除剂）和SP600125（JNK抑制剂）研究OCN通过脂联素（ADPN）或ROS-JNK信号通路在调控肝细胞脂肪化和损伤的机制。过碘酸-雪芙（PAS）法鉴定肝细胞纯度,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜分析肝细胞的超微结构,TG、ROS、ATP、SOD、GSH-Px、MDA试剂盒分析肝细胞脂肪沉积和氧化应激,ELISA检测肝细胞白介素-1（IL-1）、IL-6和TNF-α的含量,Real-time PCR检测肝细胞线粒体DNA（mt DNA）拷贝数、ADPN、PPARα、IL-1、IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、Caspase 1、Caspase 2、Caspase 3的表达,Western-Blotting检测肝细胞ADPN、PPARα、AMPK、p-AMPK、TNF-α、JNK、p-JNK蛋白的表达。试验结果显示,与对照组相比,FE增加原代鸡胚肝细胞内TG含量增加（P＜0.05）;引起了肝细胞内脂滴增加（P＜0.05）,细胞水肿明显,线粒体肿胀、膜破损并嵴断裂;同时FE导致了细胞ATP含量降低（P＜0.05）,ROS含量增加（P＜0.05）和mt DNA拷贝数增加（P＜0.05）;且FE提高炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α含量（P＜0.05）和肝细胞凋亡率（P＜0.05）;Real-time PCR结果显示FE降低了脂联素受体（AdipoR 1和AdipoR 2）的表达（P＜0.05）但对ADPN基因无影响,western-blotting结果显示FE增加了p-JNK的表达（P＜0.05）。与FE组相比,OCN处理后显著提高肝细胞的活力（P＜0.05）,降低脂肪化肝细胞内TG含量（P＜0.05）以及胞内的脂滴数量（P＜0.05）,缓解了脂肪化肝细胞水肿和线粒体肿胀,降低ROS含量（P＜0.05）,提高了ATP含量（P＜0.05）,减少炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α含量（P＜0.05）和肝细胞凋亡率（P＜0.05）,促进了脂肪化肝细胞ADPN基因和蛋白表达（P＜0.05）,提高了AdipoR 1和AdipoR 2基因的表达（P＜0.05）,抑制p-JNK蛋白表达（P＜0.05）,增加了PPARα和pAMPK蛋白表达（P＜0.05）。使用AdipoRon进一步分析ADPN信号通路在OCN调节肝细胞脂肪化过程中发挥的作用,结果显示AdipoRon也可显著提高AdipoR1和AdipoR 2基因的表达（P＜0.05）,并增加PPARα和p-AMPK表达（P＜0.05）,但对p-JNK、TNF-α蛋白表达和TG含量无显著影响（P＞0.05）。使用NAC和SP600125分析ROS-JNK信号通路的作用,结果显示,同OCN一样,NAC可减少FE诱导肝细胞ROS含量（P＜0.05）,并进一步降低p-JNK蛋白的表达（P＜0.05）;SP600125和OCN均可减少p-JNK的表达,降低炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α含量和TG含量（P＜0.05）,但对ROS含量无显著性影响。超微结构图进一步显示OCN可促进脂滴自噬的发生,显著提高自噬溶酶体的数量（P＜0.05）。综上所述,FE诱导引起原代鸡胚肝细胞的脂肪过度沉积、细胞水肿、线粒体功能障碍、炎症反应和细胞凋亡,而OCN可减轻FE诱导的肝细胞损伤和线粒体功能障碍,减少ROS含量,抑制了炎性因子分泌和凋亡,并通过ROS-JNK信号通路缓解肝细胞的炎症反应和脂肪沉积,且OCN可激活ADPNAMPK/PPARα信号通路,但其具体作用还有待研究,研究还显示OCN可能促进细胞自噬,但其机理还有待研究。
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