随着人类社会的老龄化和全球生态环境的恶化,阿尔兹海默病、帕金森综合征、脑肿瘤、脑卒中以及脑感染等脑部疾病的发病率逐年升高,因此,开发高效稳定的脑部递药系统具有积极的研究意义与价值。但血脑屏障（blood brain barrier,BBB）是脑部治疗的主要障碍,现阶段研究较为广泛的策略是基于BBB上高表达的受体蛋白,通过受体-配体相互作用介导药物实现脑部靶向递送。常见介导脑靶向的受体包括胰岛素受体（Insulin receptor,IR）、转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体及瘦素受体等,这些受体均为膜蛋白受体。膜蛋白的不同区域一般可划分为胞外区、跨膜区及胞内区。若以膜蛋白胞外区作为识别位点构建靶向递药系统可能面临两个问题:（1）体内存在可与膜蛋白胞外区作用的天然配体或内源性物质,这可能对递药系统产生竞争性干扰;（2）一些膜蛋白胞外区具有较强的可变性,针对初始胞外区设计的配体不一定能识别突变后的胞外区。因此,上述问题对于识别膜蛋白胞外区构建的靶向递药系统而言,无疑是一个潜在的挑战。基于此,本文探索了以膜蛋白更为保守稳定的跨膜区作为识别位点,进而构建脑靶向递药系统的可行性,以期能有效规避内源性竞争性干扰,及胞外区不能被有效识别等问题。以IR为研究对象,采用与IR跨膜区特异性结合的多肽（ITP）作为靶向分子构建了一种聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）化的新型脑靶向脂质体递药系统（PEG-P-Lip）。由于ITP具有较强的疏水性,其可以自发嵌入脂质体磷脂层中,这种方式无需通过化学修饰功能化多肽,也可以提高脂质体的稳定性。以抗真菌药物两性霉素B（Amphotericin B,Am B）为模型药物,将该递药系统用于治疗隐球菌脑感染,初步验证其脑靶向递药及临床应用潜力。该递药系统具有以下特征:（1）ITP修饰能够显著提高脂质体稳定性;（2）基于识别IR跨膜区,能够高效稳定地实现体内外脑靶向递送;（3）具有良好的免疫相容性。具体研究内容分述如下:1.ITP活性分析及PEG-P-Lip的制备与表征以课题组前期筛选得到的ITP为基础,表面等离子共振技术（SPR）证实ITP与IR之间具有较高的亲和力(KD=5.08×10-7M),分子对接分析表明ITP与IR跨膜区具有较强的结合作用。圆二色光谱仪测定结果显示ITP为α螺旋结构。以NPD-PE为膜探针,考察ITP修饰对脂质体膜流动性的影响,结果表明ITP修饰显著提升了脂质体的稳定性。原子力显微镜测定显示4%ITP修饰脂质体后杨氏模量约为空白脂质体的35倍,显著提高了脂质体的弹性模量。通过细胞摄取实验考察不同比例的ITP修饰与DSPE-PEG2000修饰对制剂主动靶向性的影响,筛选结果表明4%ITP与5%DSPE-PEG2000修饰组合最佳。对制备的PEG-P-Lip进行表征,结果表明:PEG-P-Lip粒径均一,平均径约为87.40 nm;透射电镜（TEM）与原子力显微镜（AFM）分析显示其形态圆整,具有明显的脂质体结构。荧光共振能量转移（FRET）实验表明PEG-P-Lip具有较好的血清稳定性。进一步制备了包载模型药物Am B的PEG-P-Lip/Am B,制剂外观澄清透亮,包封率达84.69%,体外释放速率略低于未经ITP修饰的对照组。2.PEG-P-Lip体内外主动靶向性评价本部分进一步对PEG-P-Lip体内外主动靶向性进行了评价。首先提取分离了大鼠原代脑微血管内皮细胞（BMEC）,以此为模型细胞,采用si RNA技术沉默BMEC细胞IR基因（Insr）后探究PEG-P-Lip的靶向机制,结果显示si RNA沉默Insr后BMEC细胞对PEG-P-Lip摄取显著降低,表明PEG-P-Lip经IR介导实现主动靶向。采用IR胞外区亲和肽（IEP）预饱和b End.3细胞IR胞外区,以模拟内源性干扰或胞外区不能被有效识别的情况,摄取结果显示b End.3细胞对IEP修饰的脂质体（IEP-Lip）摄取显著降低,而对PEG-P-Lip无影响,验证了ITP的作用位点为IR跨膜区,也表明PEG-P-Lip能够有效规避以胞外区为识别位点的问题。细胞内共定位实验表明PEG-P-Lip与溶酶体共定位显著低于IEP-Lip。在构建的体外BBB模型中,渗透实验显示PEG-P-Lip能够有效跨BBB。小动物活体、离体成像及组织分布实验表明PEG-P-Lip体内具有显著的脑靶向性,并且PEG修饰在体内可以加强仅ITP修饰介导的主动靶向性。这种体内靶向性在脑IR条件性敲除小鼠模型中再次得到验证,在动物水平证实了ITP修饰的靶向机制为IR介导。脑微血管渗透性实验表明PEG-P-Lip能够有效地渗透出血管再入脑,有助于脂质体在脑实质中扩散。巨噬细胞RAW 264.7摄取实验与体内药代动力学实验表明PEG-P-Lip具有长循环作用,半衰期得到有效延长。3.PEG-P-Lip抗隐球菌脑感染药效及安全性初步评价以隐球菌脑感染作为疾病模型,评价PEG-P-Lip用于治疗脑部疾病潜力及其安全性。通过MIC实验评价了PEG-P-Lip/Am B体外对隐球菌的抑制作用,结果表明其MIC值为2μg/m L,体外抗菌能力略低于游离Am B及未经ITP修饰的对照组。采用尾静脉注射的方式构建了隐球菌小鼠脑感染模型,基于此模型考察了PEG-P-Lip/Am B治疗感染小鼠的药效作用,真菌负荷及GMS染色实验表明PEG-P-Lip/Am B治疗后能够有效降低脑组织中的隐球菌数量与感染程度。生存率实验表明在感染后第42天时PEG-P-Lip/Am B组生存率仍有42%,显著提高了感染小鼠的生存率并延长了生存时间。溶血实验、血清生化指标测定及H＆E染色病理学考察初步证明PEG-P-Lip/Am B体内外无明显的毒副作用,具有良好的安全性。4.PEG-P-Lip免疫相容性评价有报道称将多肽靶向分子修饰于脂质体表面后会提高其体内的免疫原性,鉴于本文构建的递药系统是将ITP修饰于脂质体磷脂层中,减少了靶向分子在体内环境中暴露,这种策略可能会改善制剂的体内免疫相容性。因此,本章初步考察了PEG-P-Lip的免疫相容性。采用SDS-PAGE分析PEG-P-Lip吸附蛋白冠的情况,结果表明与IEP-Lip相比,PEG-P-Lip能够显著降低吸附的蛋白种类与吸附量。通过多次静脉注射脂质体刺激,以c（RGDy K）修饰的脂质体（RGD-Lip）作为阳性对照,结果显示PEG-P-Lip不会引起小鼠体温变化。免疫组化与ELISA测定结果表明PEG-P-Lip不会在组织中引起免疫复合物Ig M与Ig G沉积,也不会导致血清中的Ig M和Ig G水平上升。ELISA分析结果表明PEG-P-Lip对血清中细胞因子IL-8,IL-10,TNF-α含量无显著影响,证实PEG-P-Lip具有良好的体内免疫相容性。综上所述,本文以IR跨膜区作为靶受体作用位点,构建了一种多肽靶向分子嵌入磷脂层且PEG化的新型脑靶向脂质体递药系统。该系统能够有效规避靶蛋白胞外区被内源性物质竞争性结合或者胞外区不能被有效识别的问题,具有较好的稳定性,体内外均表现出显著的脑靶向性。该递药系统能够有效治疗隐球菌脑感染,具有较大的用于脑部疾病治疗的潜力,同时具有较好的免疫相容性。基于靶受体跨膜区构建的递药系统结构设计简单,易于制备,并具有高效稳定的靶向能力,为后续其它以膜蛋白作为靶点的递药系统设计提供了参考。