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柑橘主要通过嫁接进行繁殖。嫁接将来自不同遗传背景的材料组合成新的植株,砧木和接穗之间相互作用决定着柑橘的园艺性状和抗性。利用砧穗互作能够使树体矮化、缩短童期、提高果实产量和品质,增强植株对生物和非生物胁迫的抗性。目前关于砧穗互作的机理研究主要集中在生理生化水平、营养吸收转运、信号传导、基因的差异表达以及砧穗之间遗传物质（m RNA、mi RNA和si RNA）的交流。已有研究指出,柑橘砧穗互作会影响果实的内在品质,以及mi RNAs的差异表达,但对砧穗互作导致的果实内在品质变化与差异表达的mi RNA的关系缺乏研究报道。本论文以4个柑橘接穗品种大雅柑（Daya mandarin）（Citrus reticulata）、(鲍威尔（Powell）（C.sinensis）、斑菲尓（Banfield）（C.sinensis）、切斯勒特（Chislett）（C.sinensis）分别嫁接在枳（Poncirus trifoliata）砧（Z）和红橘（C.reticulata）砧（H）上的8种不同砧穗组合的果实为试验材料,检测了果实发育过程中决定内在品质最主要的指标糖、酸含量的变化,以及其他果实内在品质指标,分析砧穗互作中不同砧木对果实品质的影响。选择大雅柑/枳和大雅柑/红橘两个砧穗组合果实的3个不同发育时期（130,150,190DAF（Days after flowering））的汁胞进行small RNA测序,通过相关性分析,筛选与果实品质相关的差异表达mi RNAs。结合降解组测序、荧光定量PCR检测以及双荧光素酶报告基因检测和烟草瞬时表达体系,验证候选差异表达mi RNA的潜在靶基因。对候选mi RNA及其相应靶基因在8个不同砧穗组合的果实中的表达进行定量检测,分析砧穗互作对mi RNA表达的影响及其与果实糖、酸含量的关系,以探究mi RNA在砧穗互作中调控果实内在品质的途径和机制。分别构建两个过表达载体(mi RNA的前体序列和短串联靶位点模拟序列（short tandem target mimic（STTM））,通过对早实枳的遗传转化获得转基因植株。对过表达植株和野生型植株进行相互嫁接,取不同嫁接组合中嫁接口上下（砧木和接穗）的韧皮部定量检测mi RNA的表达量,探究候选mi RNA在柑橘砧穗互作中的表达特征。本论文取得的主要研究结果如下:1.枳砧上果实的可溶性固形物含量明显高于红橘砧本实验对8个不同柑橘砧穗组合（鲍威尔/枳（Powell/Z）、鲍威尔/红橘（Powell/H）、斑菲尔/枳（Banfield/Z）、斑菲尔/红橘（Banfield/H）、切斯勒特/枳（Chislett/Z）、切斯勒特/红橘（Chislett/H）、大雅柑/枳（Daya/Z）、大雅柑/红橘（Daya/H））的果实内在品质指标进行了检测,结果发现:枳砧组合果实的可溶性固形物（TSS）含量显著高于红橘砧组合;枳砧组合果实的蔗糖含量均显著高于红橘砧组合,而果糖和葡萄糖的含量则没有明显的差异。枳砧组合果实的总有机酸和可滴定酸（TA）含量明显低于红橘砧组合,在4种主要有机酸中,枳砧组合果实的柠檬酸含量明显低于红橘砧组合,而其他3种有机酸（苹果酸、酒石酸、琥珀酸）的含量则没有表现出明显的差异。维生素C的含量在两种砧木的砧穗组合间没有出现明显的差异。2.砧穗互作中差异表达mi RNA的筛选及其靶基因的预测选取大雅柑/枳（Daya/Z）和大雅柑/红橘（Daya/H）两个砧穗组合不同发育时间（130,150,190 DAF）的果实汁胞进行small RNA转录组和降解组的测序及分析。在2个砧穗组合果实的3个发育时期,共鉴定到了108个已知mi RNAs和145个新mi RNAs。2个砧穗组合间在果实发育过程中有129个mi RNAs差异表达（DEM）（48个已知mi RNAs和81个新mi RNAs）。其中在130DAF共有72个DEM,包括35个下调和37个上调的mi RNAs;150DAF共有71个DEM,包括27个下调,44个上调;190DAF共有25个和37个DEM分别发生了上调和下调表达。有25、24、20个和26、15、18个mi RNAs分别特异性的在果实发育的130、150和190DAF上调或下调表达,在整个果实发育的过程中同时有5个和2个mi RNAs分别发生了上调或下调表达。预测发现129个差异表达mi RNA存在551个靶基因。利用降解组测序共鉴定出53个已知和2个新mi RNAs的107个靶基因,其中有9个靶基因属于6个差异表达的mi RNAs。去除两种方法中的重复靶基因,共获得了555个潜在靶基因。对靶基因进行GO富集分析发现,这些靶基因的功能包括17个生物学过程、7个分子功能和10个细胞成分。KEGG富集分析显示,其中有231个基因涉及70个通路,包括代谢通路、泛酸和Co A的生物合成以及植物与病原的相互作用等。3.影响柑橘果实内在品质的mi RNA筛选对果实发育过程中同时差异表达的7个mi RNAs与决定果实内在品质最重要的指标TSS和TA含量进行相关性分析,发现有4个mi RNAs（Cre-mi R159-3p/-mi R160a/mi R171b/mi R399-3p）与这2个果实内在品质指标之间存在显著的相关性,而且这些mi RNAs的靶基因可能与果实内在品质形成的代谢通路相关,比如SCL、GAMYB、ARF等转录因子。6个脐橙砧穗组合果实的内在品质和4个候选mi RNAs的表达量也存在显著的相关性。3个脐橙/红橘砧组合的果实的TSS含量与Cre-mi R399-3p呈显著正相关;红橘砧斑菲尓和切斯勒特果实的TA与Cre-mi R399-3p呈显著正相关。通过q RT-PCR分析了4个候选mi RNAs及其预测的靶基因在8个砧穗组合果实发育过程中的表达,发现枳砧斑菲尔、切斯勒特和大雅柑果实中Cre-mi R159-3p的表达与其靶基因GAMYB的表达只在切斯勒特果实中呈相反趋势;Cre-mi R160a在这8个砧穗组合的果实发育过程中的表达没有表现出一致的变化趋势,说明Cre-mi R160a可能与果实发育过程关系不密切,不是砧穗互作中影响果实内在品质的主要因素;枳砧鲍威尔和斑菲尔果实中Cre-mi R171b的表达变化与其靶基因SCL的表达仅在枳砧斑菲尔中表现出相反模式;枳砧斑菲尔、切斯勒特和大雅柑果实中Cre-mi R399-3p的表达与其靶基因INVE的表达在斑菲尔和切斯勒特中的变化模式均相反。由此可以推测Cre-mi R399-3p及其靶基因INVE在枳为砧木的砧穗互作中与果实的内在品质相关。4.Cre-mi R399的靶基因验证生物信息学预测、q RT-PCR定量分析和降解组测序预测Cre-mi R399可能有3个靶基因LAC（Laccase）、INVE（Neutral/alkaline invertase）和DSR（Double-stranded RNA）与砧穗互作相关。为了鉴定Cre-mi R399的靶基因,以及验证Cre-mi R399是否能够在植物体内抑制靶基因的表达。通过双荧光素酶报告基因检测发现,Cre-mi R399对其3个候选靶基因都有一定程度的抑制效果,但对靶基因INVE的抑制效果更明显。烟草瞬时表达体系验证发现,当用Cre-mi R399和靶基因INVE共同注射烟草,烟草叶片中的荧光信号发生了明显减弱。由此可以表明,INVE是Cre-mi R399的靶基因。5.Cre-mi R399参与了转基因柑橘的砧穗互作本论文通过转基因获得了Cre-mi R399干扰和过表达的柑橘植株,与对照相比,干扰植株和过表达植株中的Cre-mi R399表达水平均分别显著下调或上调。将过表达的转基因植株与野生型植株进行相互嫁接,分别对嫁接口上下端位于砧木茎段和接穗茎段部分的韧皮部中Cre-mi R399的表达量进行了定量检测。结果显示,野生型接穗嫁接到过表达砧木的植株,在嫁接后的第14天,野生型接穗中Cre-mi R399的表达量明显上升,嫁接后的第40天表达量依然处于高水平;Cre-mi R399过表达植株作为接穗嫁接到野生型植株砧木上,Cre-mi R399在接穗和砧木中的表达量均没有发生明显的变化,自嫁接的野生型和过表达植株中,嫁接口上下端韧皮部中Cre-mi R399的表达量也没有明显差异。以上结果表明Cre-mi R399参与了砧木对接穗的互作。在有表达差异的接穗和砧木间,可能高表达Cre-mi R399的砧木可以通过互作诱导Cre-mi R399在接穗中的高表达,或Cre-mi R399可能从高表达的砧木向低表达的接穗移动。这种现象产生的潜在机理还需要后续更多的实验去证明。