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利福平(Rifampin，RIF)是治疗结核病的一线药物，属于半合成的利福霉素类抗生素。利福霉素类抗生素拥有相同的分子构架—安莎桥和萘酚环，而不同之处在于萘酚环上连接的取代基（常被称为R基团）。RIF的作用靶点是细菌的RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)，具有广谱抑菌活性。RIF的大量使用已经导致病原菌产生了多种抗药机制。近年来，人们在细菌中发现了一种RIF抗性蛋白，利福平磷酸转移酶(Rifampin Phosphotransferase，RPH)。它可以利用ATP对RIF及其他利福霉素类抗生素的C21位羟基进行磷酸化修饰，使RIF丧失抑菌活性。RPH在细菌中广泛存在，其中包含多种致病菌，对传染病的防治构成了巨大威胁。通过序列分析，人们发现RPH不同于任何已知的抗生素抗性蛋白，由三个结构域组成:ATP结合结构域(ATP-binding Domain，AD)、RIF结合结构域(RIF-binding Domain，RD)和与催化相关的His结构域(His-containing Domain，HD)。然而，人们对RPH磷酸化RIF致其失活的分子机理并不了解。 本研究中，纯化了李斯特菌（Listeria monocytoge nes）来源的RPH蛋白(LmRPH)，建立了基于高效液相色谱(HPLC)的体外酶活检测系统和基于大肠杆菌（Escherichia coli）的RIF抑菌实验体系，并对LmRPH的催化活性和反应产物进行了分析和鉴定。通过蛋白质结晶的方法，首先获得了LmRPH全长蛋白结合底物RIF和ATP类似物AMPPNP的晶体，采用单波长反常散射法解析了该复合体3.1(A)的晶体结构，LmRPH-ANP-RIF。进而基于结构分析将Gly527进行突变，并最终获得了G527Y突变体蛋白处于apo状态和结合AMPPNP状态的结构，LmRPHG527Y-apo和LmRPHG527Y-ANP。LmRPH的三个结构域相对独立，LmRPH-ANP-RIF结构中HD与RD结合，处于HD-RD构象;而LmRPHG527Y-apo和LmRPHG527Y-ANP结构中HD与AD结合，处于HD-AD构象。通过结构分析和生化实验验证，发现LmRPH处于HD-AD构象时，HD稳定了AD中的ATP结合位点，ATP靠氢键和Mg2+介导的配位键结合在AD中。通过Phos-tag SDS-PAGE和质谱分析，发现HD中的保守氨基酸His825在这个过程中被磷酸化，很可能充当磷酸基团的受体。随后，HD从AD摆动到RD形成HD-RD构象，与RD共同形成了RIF结合位点。RIF的分子构架—安莎桥和萘酚环通过疏水作用稳定在结合口袋中，而R基团则指向结合口袋外侧，这种结合方式很好地解释了为什么RPH对利福霉素类抗生素都具有催化活性。His825位于RIF结合口袋底部，其携带的磷酸基团在一对碱性氨基酸Lys670/Arg666的作用下被转移到RIF分子的C21位羟基上。整个催化过程中，HD通过在AD和RD之间摆动实现磷酸基团在大概50(A)距离内的传递。将RPH的催化机理形象地描述为“拨动开关模型”。基于这一模型，提出可将RIF的C21羟基用其他非活性基团取代来抑制RPH的磷酸化，进而达到解决RPH导致的RIF及利福霉素耐药性问题。 本研究解析了RIF磷酸转移酶RPH处于两种不同活性状态的三种结构，揭示了RPH催化RIF磷酸化的反应过程，提出了催化过程的分子模型。基于研究结果提出了新一代利福霉素类抗生素研发的方向，希望能最终帮助人们克服RPH介导的细菌对利福霉素类药物的耐药问题。