论文部分内容阅读
目的：RUNX3基因是最近发现的一个抑癌基因,其与乳腺癌关系的研究尚未见报道。本实验拟通过观察RUNX3基因在乳腺癌中的表达情况,分析其在乳腺癌中的功能状态,并分析其与乳腺癌临床病理参数的关系,明确RUNX3基因在乳腺癌诊断及预后评价中的作用。通过细胞培养及基因转染技术,明确RUNX3基因是否可作为乳腺癌发生过程中的一个抑癌基因,分析其影响乳腺癌细胞生长增殖的机制。
方法：1、培养乳腺癌细胞系(5种,包括Bcap37、ZR-75-30、BT549、SK-BR-3、MCF-7)及正常乳腺细胞系Hs578Bst,并应用RT-PCR及Western Blot方法检测这些细胞系中RUNX3基因的mRNA及蛋白水平表达情况。并将最后结果经实时定量PCR验证,分析RUNX3基因在乳腺癌中的表达情况,筛选出RUNX3基因表达阴性的细胞系,为后续的实验奠定基础。2、选取新鲜的乳腺癌组织与配对癌旁正常组织标本各30例,用上述相同的方法研究RUNX3基因在乳腺癌组织中的表达情况,并分析RUNX3基因在mRNA和蛋白水平表达的差异。3、应用免疫组化方法研究RUNX3基因在88例乳腺癌组织、40例正常乳腺组织和40例乳腺纤维腺瘤中的表达情况。RUNX3基因表达与乳腺癌临床病理参数间的相关性,明确RUNX3基因在乳腺癌诊断及判断预后方面的价值。4、分析RUNX3基因表达与细胞周期相关基因如cyclin D1、p27kipl表达的相关性；分析RUNX3基因与凋亡相关基因如Bcl-2、Bax表达的相关性,探讨RUNX3基因发挥抑癌作用的机制。5、应用MSP方法研究RUNX3基因在人乳腺癌中启动子甲基化状态,分析RuNX3启动子区甲基化与临床病理参数的关系,探讨RuNX3表达缺失的原因。6、RUNX3基因真核表达质粒构建及稳定转染乳腺癌细胞系,筛选出稳定转染克隆,应用MTT法研究转染RUNX3基因前后的乳腺癌细胞系与转染空质粒的细胞系生长情况有无不同,并绘成生长曲线；应用流式细胞仪分析转染RUNX3基因前后的乳腺癌细胞系的细胞周期变化,进一步探讨RUNX3抑癌作用的机制。
结果：1、通过RT-PCR、Western Blot和Real time PCR方法分析表明,在6个细胞系中,T47D、MCF7和SKBR3的RUNX3mRNA和蛋白阴性表达,其余阳性表达。在BT549中虽然检测到RUNX3的表达,但表达量相对较低。乳腺癌组织中RUNX3mRNA和蛋白的表达明显低于癌旁正常组织。 2、乳腺癌组织中RUNX3的表达明显低于乳腺纤维腺瘤及乳腺增生病组织,RUNX3基因在乳腺纤维腺瘤及乳腺增生病组织中的表达差别无统计学意义。RUNX3蛋白表达与乳腺癌有无浸润、临床分期、淋巴结转移、ER、PR表达相关,而与病人的年龄、肿瘤类型、病理分级无关。RUNX3表达阳性者的生存率高于表达阴性者的生存率(P<0.05)。RUNX3阳性表达者,术后生存时间长。3、乳腺癌中RUNX3与Bcl-2蛋白的表达呈正相关性,与Bax的表达无相关性；RUNX3与p27kipl蛋白的表达呈正相关性,与cyclinD1的表达呈负相关性。4、在6种细胞系中,有两种(T47D、MCF7)RUNX3呈高甲基化状态,其它4种呈非甲基化状态。在30例乳腺癌中有13例(43.33％)检测出RUNX3甲基化,而在癌旁正常乳腺组织中没有检测出RUNX3启动子区的甲基化。在9例临床分期为Ⅲ期的乳腺癌病例中,有7例(77.78％)检测出RUNX3启动子区的甲基化；在所检出的存在RUNX3启动子区甲基化的13个病例中,有9例(69.23％)发生淋巴结转移。5、用pcDNA3.1(+)作为载体,成功构建了pcDNA3.1(+)/RUNX3真核表达质粒,为后续实验奠定了基础。6、利用Lipofectamine2000介导的方法将RUNX3基因导入乳腺癌T47D细胞,得到稳定表达；MTT法检测细胞活性表明,转染RUNX3基因后T47D/RUNX3细胞的生长受到明显的抑制,与空白组、空质粒组相比差异具有显著意义,而空白组和空质粒组相比没有统计学差异；用流式细胞仪分析细胞周期表明,转染RUNX3基因组G0/G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例下降,说明RUNX3表达能使T47D细胞阻滞于GO/G1期。
结论：1、RUNX3基因在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中表达降低,证明RUNX3基因可能作为一个抑癌基因参与乳腺癌的发生。2、随着乳腺癌的临床进展,RUNX3表达下降；在乳腺癌发展中RUNX3与Bel-2、p27kipl起正协同作用,而与cyclinD1作用相反,提示RUNX3是通过抑制细胞周期和促进细胞凋亡发挥抑癌作用；检测RUNX3基因在乳腺癌中的表达对评价患者的预后有一定价值。3、RUNX3基因在乳腺癌中失活的机制可能为启动子区的甲基化,RUNX3有望成为乳腺癌分子诊断和病期评估的标志之一。4、应用分子克隆技术成功构建了含RUNX3基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/RUNX3,为今后RUNX3基因在癌组织中的功能研究提供实验基础。5、成功建立高表达RUNX3基因的T47D细胞系；RUNX3基因高表达能使T47D细胞在体外生长速度减慢,证明RUNX3基因表达增强对T47D细胞增殖具有一定的抑制作用；RUNX3基因高表达后将T47D细胞阻滞于G0/G1期,T47D细胞的凋亡率显著增加,这说明RUNX3基因通过调控细胞周期和促进细胞凋亡发挥抑癌作用。