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补阳还五汤是中医临床治疗缺血性中风的常用方剂,由七味中药:黄芪、川芎、当归、赤芍、红花、桃仁、地龙组成,本方具有“补气,活血,通络”之功效。本研究运用指纹图谱技术、神经元样PC12细胞膜固相色谱法及UPLC-MS/MS分析技术对补阳还五汤的“神经保护”效应物质基础进行探索研究,利用氧糖剥夺再灌注模型的皮层、海马神经元初步验证特异结合成分的药效,为探索确定补阳还五汤确切药效成分及其方剂现代化奠定基础。目的:运用神经元样PC12细胞膜固相色谱法结合UPLC-MS/MS分析技术筛选补阳还五汤中与神经元样PC12细胞膜具有特异性结合的成分,利用CCK8试剂检测氧糖剥夺再灌注模型的皮层、海马神经元存活率,以探讨其“神经保护”效应物质基础。方法:1.补阳还五汤提取物指纹图谱及含量测定方法的建立以色谱柱:依利特HypersilODS2(4.6mm×250mm,5μm),流动相:乙腈-0.1%甲酸水进行梯度洗脱,建立在250nm波长下补阳还五汤提取物指纹图谱,并利用相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版”多点校正MARK峰匹配模式对10批补阳还五汤提取物相似度进行研究。以色谱柱:依利特Hypersil ODS2(4.6mm×250mm,5μm),流动相:乙腈-0.1%磷酸水进行梯度洗脱,对补阳还五汤提取物中的黄芪甲苷、阿魏酸、芍药苷及川芎嗪进行含量测定。2.神经元样PC12细胞的培养与鉴定利用神经生长因子共培养技术及免疫荧光鉴定技术,诱导未分化PC12细胞分化成神经元样PC12细胞,为细胞膜固相色谱提供充足细胞来源。3.补阳还五汤神经元样PC12细胞膜固相色谱法的建立通过神经元样PC12细胞悬液与补阳还五汤的结合与解离,建立神经元样PC12细胞膜固相色谱法,集合固相萃取技术富集浓缩,对补阳还五汤提取物中的“神经保护”成分进行研究。4.UPLC-MS/MS分析神经元样PC12细胞膜固相色谱法的特异结合成分运用UPLC-MS/MS分析技术对神经元样PC12细胞膜固相色谱法特异结合成分进行探索研究。5.神经元样PC12细胞膜固相色谱法的特异结合成分的初步药效验证运用氧糖剥夺再灌注模型的原代皮层、海马神经元,利用CCK8试剂检测吸光度对神经元样PC12细胞膜固相色谱法特异结合成分进行初步药效探索研究。结果:1.补阳还五汤提取物指纹图谱及含量测定方法的建立建立了补阳还五汤提取物的指纹图谱,得到15个共有峰,10批补阳还五汤提取物相似度大于0.9,指纹图谱方法稳定性、重复性、专属性良好。10批次补阳还五汤提取物样品中的黄芪甲苷、阿魏酸、芍药苷、川芎嗪含量分别为:2493.423～2693.621,2.540～4.392,1428.322～1564.047,2.763～3.737μg/mL。2.神经元样PC12细胞的培养与鉴定利用神经生长因子共培养技术及免疫荧光鉴定技术,1OOng/mL神经生长因子诱导未分化PC12细胞4d,即可分化未分化PC12细胞成神经元样PC12细胞。3.补阳还五汤神经元样PC12细胞膜固相色谱法的建立利用补阳还五汤提取物与神经元样PC12细胞悬液结合,洗涤未结合成分的方法建立了神经元样PC12细胞膜固相色谱法,获得了含有9个色谱峰的解离液,该方法具有良好重现性(RSD<3.00%)。4.UPLC-MS/MS分析神经元样PC12细胞膜固相色谱法的特异结合成分建立UPLC-MS/MS分析方法对神经元样PC12细胞膜固相色谱法特异结合成分进行研究,获得6种化合物信息,具体化合物如下:6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷,6-羟基山奈酚-3,6-二-O-葡萄糖苷,毛蕊异黄酮苷,没食子酰芍药苷,芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷,7,2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷。5.神经元样PC12细胞膜固相色谱法的特异结合成分的初步药效验证建立原代皮层、海马神经元的氧糖剥夺再灌注模型,CCK8试剂检测吸光度值的结果显示,6种化合物在适宜浓度范围下的平均存活率均高于模型组,与补阳还五汤提取物组相当,即表现为促进神经元存活。神经元样PC12细胞膜固相色谱法筛选的6种特异结合成分可能是补阳还五汤“神经保护”药效成分。结论:建立了补阳还五汤提取物的指纹图谱和含量检测方法;建立神经元样PC12细胞膜固相色谱法,并利用其筛选出6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷,6-羟基山奈酚-3,6-二-O-葡萄糖苷,毛蕊异黄酮苷,没食子酰芍药苷,芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷,7,2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷6种成分,并对筛选出的6种成分利用氧糖剥夺再灌注的原代皮层、海马神经元细胞模型初步探索其药效,均表现为提高神经元在氧糖剥夺再灌注条件下的存活率。