研究背景鼻咽癌（Nsopharyngeal carcinoma,NPC）是鼻咽上皮源性恶性肿瘤,是我国南方和东南亚地区常见的头颈部恶性肿瘤之一。据报道全世界每年大于80%的新增病例发生在这些地区,其中中国的广东人群发病率最高。高发区人群在移居其它地区后,仍保持较高的发病率。10%的鼻咽癌患者有肿瘤家族史。提示除了环境因素和EB病毒感染之外,遗传易感性在鼻咽癌发病中起着非常重要作用。此外,鼻咽癌的发病有一定的性别差异,据调查,男女患者比例通常为2～3:1。鼻咽癌是一种多基因遗传性疾病,涉及多个遗传易感位点,由遗传因素、EB病毒感染及环境因素等诸多因素共同作用导致。MHC（Major histocompatibility complex）位于 6 号染色体短臂上的 21.3 区（6p21.3）,全长约4Mb,包括一系列紧密连锁的基因座,有224个基因,其中128个为功能性基因,96个为假基因,是目前已知的人类染色体中基因密度最高和多态性最为丰富的区域,因此被称为“人类体内的化学指纹”。许多经典和非经典的MHC基因的产物是配体、受体、相互作用蛋白、转录因子,涉及到适应性免疫反应中部分炎症反应、抗原的加工和递呈以及天然免疫中部分NK细胞和细胞因子的相互作用过程。MHC在人类中又称作是HLA（人类白细胞抗原）,是目前所知最为复杂的调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统。HLA基因具有高度的多态性和广泛的连锁不平衡性,一直被认为与一些感染、慢性炎症、自身免疫性疾病以及一些肿瘤的发生有关。自二十世纪七十年代年以来,许多研究不断地揭示MHC与鼻咽癌存在着潜在的关联。MHC在鼻咽癌遗传易感性中扮演重要角色,其在调节抵抗EB病毒感染的天然和特异性免疫反应中发挥重要作用,是一些与易感位点紧密连锁的遗传性标记。近来,两个研究小组分别对台湾地区和华南地区鼻咽癌人群做了全基因组关联研究（Genome Wide Association Study,GWAS）,除了发现少数新的易感位点之外,还发现MHC区域存在着重要的鼻咽癌易感位点。我们之前的meta分析研究也显示在鼻咽癌高发地区人群中MHC区域分布特征与低发地区存在明显差异。MHC测序最早开展于1999年,其扩展性的测序任务在2003年完成。这些工作曾被期以重望。然而,MHC区域是人类基因组中最复杂的区域,其复杂的多态性和高频率的重复以及大范围的连锁不平衡往往使得MHC区域易感位点与疾病表型的全基因组关联研究变得十分复杂。虽然许多研究（包括两个GWAS研究）都在MHC区域发现了一些与鼻咽癌易感性相关的潜在SNP位点,但绝大多数位点都落在基因的非功能区域。迄今,在MHC区域中,有功能意义的鼻咽癌易感位点或者基因并没有真正被鉴定和发现。新一代测序技术的发展为人们对疾病的认识和对疾病的预防、诊断及治疗的研究提供了新的思路。Sureselect靶向序列捕获系统是安捷伦公司在2009年期间研发和推广出的一种基于二代测序的基因组学分析技术,该系统可以只对人们感兴趣的基因区域进行测序,提高工作效率,降低花费。更为重要的是,该分析系统允许一次性试验检测多重样品,对起始样品DNA需要量也相对较低,有利于研究者分析更多的样本以满足统计学的要求。目的基于MHC是鼻咽癌重要的易感区域,而人MHC基因组又比较复杂,我们利用安捷伦SureSelect靶向序列捕获系统,全面精细地捕获整个MHC区域（屏蔽基因组重复序列）,然后,利用二代高通量测序结合后续的大样本关联分析验证,找出有潜在功能的SNP位点,并进一步对重要的位点及与其相关联的易感基因的分子机制和功能作用进行探讨。方法1.利用靶向捕获系统结合高通量测序初步筛查MHC区域易感位点（1）在安捷伦eArray网站上设计探针,订制SureSelect靶向捕获试剂盒,依照试剂盒说明书处理40例鼻咽癌样本基因组DNA,进行MHC区域的靶向捕获。（2）运用新一代高通量测序技术对捕获的片段进行测序。（3）将测序结果与40例来自千人基因组计划的中国汉族人MHC基因组序列进行比对,运用生物信息方法、LRT及Fisher’s exact分析方法发现与鼻咽癌可能有关联的SNP位点。（4）利用生物信息学分析,筛选出有潜在功能的SNP位点。2.用Sequenom MassArray系统对靶向捕获测序结果进行两阶段的关联分析和验证（1）第一阶段,用297例鼻咽癌患者和611例正常对照对靶向捕获测序发现的有潜在功能的SNP进行初步验证,找出有显著性关联的SNP位点。（2）第二阶段,将一阶段有意义的位点在另一个独立样本集（768病例和1526对照）中进行进一步验证和分析。（3）合并两次关联分析的数据,最终确定有显著性关联的潜在功能SNP位点。3.对其中有兴趣的SNP位点的作用和基因调控机制进行探讨（1）用生物信息学软件 TFSEARCH（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）和 FastSNP（http.ibms.sinica.edu.tw/pages/inputnovel.isp）预测SNP位点的对基因（如TRIM26）的可能调控作用。（2）收集108例鼻咽癌组织与相对应的外周血单个核细胞（PBMC）,并提取基因组 DNA,用 High-resolution DNA melting analysis（HRM）法进行 SNP 分型。（3）用实时荧光定量PCR和免疫组化染色（IHC）的方法检测不同SNP分型组织和PBMC以及男女不同SNP分型组织和PBMC的TRIM26基因表达差异。（4）选取不同SNP分型的男女组织标本,运用染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）对结合到预测位点的转录因子进行验证,并通过荧光素酶报告系统实验予以进一步的证实。4.进一步探讨与功能性SNP位点相关的基因TRIM26的生物学功能。（1）用实时荧光定量PCR技术方法检测108例鼻咽癌组织和43例正常鼻咽组织以及相应的PBMC中TRIM26的表达情况。（2）应用显著性分析微阵列方法（SAM）和GenCLiP软件对GEO上一组基因表达谱数据（GSE40290）进行深度挖掘,找出与TRIM26相关的差异表达基因,并进行GO（Gene Ontology）分析。（3）通过实时荧光定量PCR技术,在鼻咽癌组织和对应的PBMC中证实挖掘出的一些重要的免疫相关基因的表达变化及与TRIM26的关系。（4）在鼻咽癌细胞株5-8F、CNE2、Sune1和正常人的PBMC中,瞬时转入化学合成的siRNA片段,干扰TRIM26基因的表达,通过实时荧光定量PCR检测几个重要的免疫相关基因的表达情况。（5）在上述三个细胞株以及正常人的PBMC中,用IFNα2b处理后,通过实时荧光定量PCR检测几个重要的免疫相关基因的表达情况。（6）选择一株鼻咽癌细胞株CNE2和正常人的PBMC细胞,首先瞬时转染siRNA,特异性地敲低TRIM26表达,然后加入IFNα2b刺激后,通过WB检测几个重要基因的表达变化情况。（7）选取鼻咽癌细胞株CNE2与正常人的NK细胞,在进行siRNA干扰TRIM26后,共培养。观察不同处理情况下,NK细胞对鼻咽癌细胞体外培养的细胞杀伤能力的变化。（8）进一步对GSE40290基因表达谱数据进行挖掘,分别分析鼻咽癌TRIM26高表达和低表达组织与与正常对照组织的基因表达差异情况。5.Plink（1.07）软件用于各阶段SNP等位基因频率与鼻咽癌的关联分析以及40例鼻咽癌病人和千人基因组计划中的健康中国人群进行的MHC区域的主成分分析（PCA）,以P<0.05作为差异具有统计学意义。GRAPHPAD PRISM 5统计软件用于比较不同组织样本类型、样本分型和处理分组的基因的平均相对表达水平以及比较不同处理组的NK细胞的平均细胞杀伤性,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.靶向捕获系统结合高通量测序初步筛查了 MHC区域易感位点并进行两阶段关联分析验证首先对40例鼻咽癌病人MHC区域靶向捕获测序后,与千人基因组计划中的40例中国汉人的MHC序列比对,发现了 5066个有潜在关联的SNP位点（LRT≥2,Fisher’s exact test P<0.05）,我们重点关注了 155个具有调控功能（包括错义、剪切位点和调控区域）的SNP位点,包括81个SNPs（LRT≥5）和74个SNPs（Fisher’s exact test P<0.001）。这些潜在关联的SNP位点被选中进行随后的两阶段关联分析验证。第一阶段:在297例鼻咽癌病人和61 1例正常对照,成功分型和验证1 1 1个潜在关联的功能性SNP位点。经统计分析,9个SNP与鼻咽癌有显著的关联。第二阶段:在另一组独立的768例鼻咽癌病人和1526例正常人对照的样本中,进一步验证这9个位点,其中5个SNP位点有显著的关联性。对两阶段的数据进行综合分析,发现chr630280350（新位点）、rs1265053、rs1610696、chr631190425（新位点）、rs17604492这五个SNP位点与鼻咽癌有显著性关联,其中chr630280350和rs1265053与鼻咽癌显示出最显著统计学意义的关联,远远超出了 Bonferroni调整后的GWAS显著性意义的阈值,P值分别为 2.750x10-19和 8.620 x10-20,OR 值分别为 1.909 和 0.6024,并分别落在 TRIM26和C6orf15基因上。2.初步研究了 novel-1（Chr6 30280350）位点影响TRIM26基因表达调控（1）用生物信息学软件（TFSEARCH和FastSNP）预测结果显示:novel-1（Chr6 30280350）位点位于TRIM26启动子的下游区域。不同的novel-1（Chr6 30280350）的等位基因能产生不同转录因子结合位点。T出现时,所在序列会产生一个转录因子结合位点（MZF1）,而A则产生4个的潜在的转录因子结合位点（SRY、MZF1、STATx、C/EBP）,其中转录因子SRY结合位点的得分最高。（2）对组织进行分型后Real-time PCR检测和免疫组织化学染色结果显示,novel-1（Chr6 30280350）AA/AT型的鼻咽癌组织和相应的PBMC较TT型鼻咽癌组织和相应的PBMC的TRIM26的表达显著性降低。（3）染色质免疫共沉淀实验（ChIP）结果表明,SRY与等位基因A产生的转录因子结合位点结合,而不与T位点产生的转录因子结合位点结合。（4）双荧光素酶报告系统实验也同样证实了 SRY与TRIM26的5’UTR的A位点产生的转录因子的结合位点结合,从而抑制TRIM26的转录过程。（5）由于SRY是一个性别决定基因,只有男性个体才表达SRY。因此我们将SNP分型的组织的realtime PCR和免疫组织化学染色的结果按照性别重新分类进行分析。结果表明,具有AA/AT型的男性鼻咽癌组织和对应的PBMC标本的TRIM26的表达水平显著低于TT型的男性的鼻咽癌组织和PBMC,也显著低于女性,而在女性中AA/AT与TT型两组的TRIM26表达水平差异无统计学意义。3.探讨了 TRIM26基因的表达下调与鼻咽癌病人低免疫状态的关系（1）用实时荧光定量PCR检测了 108例鼻咽癌组织和PBMC以及43例正常鼻咽组织和PBMC的TRIM26表达情况。结果显示,无论是鼻咽癌患者组织标本还是PBMC标本,其TRIM26基因的表达都显著低于正常对照组。这一结果与我们前期实验室提交GEO的一组鼻咽癌基因表达谱数据（GSE40290）一致。（2）为探索TRIM26在鼻咽癌中的功能相关性,应用显著性分析微阵列方法（SAM）和GenCLiP软件对GEO上一组基因表达谱数据（GSE40290）进行深度挖掘,把鼻咽癌芯片样本分为TRIM26高表达和TRIM26低表达两组,重新聚类分析,在△=0.94和FDR=0.05标准下,共发现307个基因在TRIM26低表达一组中呈现低表达,但没有发现高表达的基因。GO分析显示这些下调的基因均与免疫应答、天然免疫反应以及抗病毒有关,主要参与一些正向调控反应。（3）在鼻咽癌高表达TRIM26、低表达TRIM26的组织和患者的PBMC中检测和验证芯片分析发现的一些重要的免疫相关基因（IRF7、NFKB2、IL-32、CD38和STAT1）,发现大部分免疫相关基因在TRIM26低表达的鼻咽癌组织和PBMC中确实表达下调。（4）为了更直观地观察鼻咽癌中TRIM26基因表达与免疫基因表达或者调控的相关性,我们选取三个鼻咽癌细胞株（5-8F、CNE2和Sune1）和正常人的PBMC,瞬时转入化学合成的siRNA片段干扰TRIM26基因的表达后,实时荧光定量PCR检测IRF7、NFKB2、IL-32和CD38的表达情况,发现下调TRIM26确实显著减弱了这些免疫相关基因的表达,并呈明显的剂量依赖关系。（5）由于IFN可以介导一些TRIM基因的表达,因此我们用IFNα2b处理三个鼻咽癌细胞株（5-8F、CNE2和Sune1）和正常人的PBMC后,通过实时荧光定量PCR检测几个重要的免疫相关基因IRF7、NFKB2、IL-32和CD38的表达情况,我们发现IFN刺激三个鼻咽癌细胞株（5-8F、CNE2和Sune1）和正常人的PBMC之后,TRIM26无一例外都显著地增加了表达水平并且也与IFNα2b呈一定的剂量反应关系,免疫相关基因IRF7、NFKB2、IL-32和CD38的表达也相应地增加,差异有统计学意义。（6）为了证实是否TRIM26的降低影响IFN介导的免疫反应,我们选择一株鼻咽癌细胞株CNE2和正常人的PBMC细胞,首先瞬时转染siRNA特异性的敲低TRIM26的表达,然后加入IFNα2b刺激后,通过WB检测免疫相关基因的表达情况,发现TRIM26的下调削弱了 IFN介导的免疫反应。（7）为了证实是否TRIM26能够通过削弱免疫细胞的免疫识别杀伤能力和肿瘤细胞的免疫原性从而影响鼻咽癌的免疫应答,我们选取鼻咽癌细胞株CNE2与正常人的NK细胞,在进行siRNA干扰TRIM26基因表达处理后,共培养,观察不同处理情况下,NK细胞对鼻咽癌细胞体外培养的细胞杀伤作用,我们发现特异性敲低TRIM26的NK细胞与鼻咽癌细胞株CNE2共培养体系中,NK细胞对CNE2细胞的杀伤作用较正常的NK细胞与CNE2共培养体系明显削弱;正常的NK细胞与特异性敲低TRIM26的鼻咽癌细胞株CNE2共培养体系,NK细胞对CNE2细胞的杀伤作用较正常的NK细胞与CNE2共培养体系也明显削弱;同时特异性敲低NK细胞和CNE2细胞的共培养体系,表现出最弱的细胞杀伤毒性。（8）我们进一步对GSE40290基因表达谱数据进行挖掘,比较了鼻咽癌中TRIM26高表达低表达和正常健康对照组的基因表达差异。我们发现与正常对照组相比,有3711个基因在TRIM26低表达的鼻咽癌中差异表达（△=0.94,FDR=0.045）,而有573个基因在TRIM26高表达的鼻咽癌中差异表达（△=0.94,FDR=0.114）。结论1.通过安捷伦SureSelect 靶向捕获测序技术得到155个与鼻咽癌相关联的潜在的功能性SNP位点,经两个阶段的关联分析验证,发现5个鼻咽癌候选易感位点,其中novel-1（Chr6 30280350）和rs1265053与鼻咽癌显示出最显著的关联。2.novel-1（Chr6 30280350）位点的等位基因A能在TRIM26的5‘UTR区域产生一个新的转录因子结合位点,结合男性特有的SRY,降低TRIM26的表达水平,进而增加鼻咽癌易感性尤其是男性鼻咽癌的易感性。3.TRIM26下调可以影响一些重要的免疫相关基因的表达,降低NK细胞对肿瘤细胞的识别杀伤能力和鼻咽癌细胞免疫原性,与鼻咽癌的低免疫状态密切相关。4.TRIM26低表达可导致更广泛的基因表达紊乱,包含多个信号通路的失调,从而赋予更高的鼻咽癌易感性。