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野猪作为一种具有重要经济价值的资源兽,具有耐粗饲、抗病力强、瘦肉率高,等优良特性;野猪作为现代家猪的直接祖先,能直接和家猪杂交产生可育后代。因此,对野猪遗传资源进行研究评估,既能起到保护遗传资源的作用,又能利用它们来形成稳定新型猪种。本试验以野猪为材料,选取与生长发育紧密相关的生长激素基因和与肌纤维形成相关的肌细胞生成素基因作为研究对象。采用常规分子生物学技术手段以获得这两个基因的全序列,并结合分子生物信息学方法对基因序列进行系统性的分析,对这两个基因在野猪驯化为家猪的过程中的变化情况进行初步性的研究,为充分利用野猪遗传资源,进行家猪品种改良奠定一定的基础,同时也对野猪遗传资源的科学保护提供一定的资料。本实验获得的研究结果如下:
1.野猪生长激素(GH)基因序列的测定与分析
1)通过自行设计的引物,利用PCR技术,在5个野猪个体中获得了包括GH基因全部外显子和内含子在内的1 792bp的GH基因全序列,据根GH基因序列推测,cDNA全长为651bp,GH基因整体的氨基酸总数目为216个。
2)野猪GH基因核苷酸组成富含GC(61.94%)。G+C含量明显高于A+T含量(38.06%)。野猪GH基因全序列与家猪不同品种的GH基因序列的同源性为98-99%;野猪GH基因编码序列与其它哺乳动物的GH基因编码序列的同源性为76-93%,与不同物种同源性的高低反映野猪与这些动物种类亲缘关系的远近。
3)野猪GH基因一级结构存在丰富的核苷酸多样性。本实验所测的5个野猪个体生长激素基因序列与Vize等发布的GH基因序列比较,检出44个核苷酸变异位点,占分析位点总数的2.45%;在野猪的44个变异位点中,有21个为家猪中不具有的新变异位点,占分析位点总数的1.17%,占突变位点总数的47.72%。
4)野猪GH基因序列的绝大多数变异位点发生在内含子部分,5′端侧翼区无变异位点,3′端侧翼区检测6个变异位点;在外显子中检测到9个变异位点,主要集中在外显子2和3,外显子1,4,5内均未检测到变异位点。在外显子内的这9个变异位点中,有4个为同义突变,5个为非同义突变。
5)在发生核苷酸取代的位点中,36个位点为转换型突变,仅8个位点发生了颠换型突变,转换(si)与颠换(sv)之比为9:2,说明野猪GH基因序列变异中存在转换偏倚现象。
6)野猪种群内个体间的平均遗传距离为0.0082(S.E=0.0014),家猪种群内各品种间的平均遗传距离为0.0053(S.E=0.0011),野猪种群和家猪种群间的平均遗传距离为0.0076(S.E=0.0012)。该结果表明,野猪种群内个体间的平均遗传距离大于家猪种群内各品种间的平均遗传距离(0.0082>0.0053),同时还大于野猪和家猪种群间的遗传距离。
7)野猪与不同品种猪的GH基因树显示,野猪与内江猪的亲缘关系最近,与广西巴马小猪和海南五指山猪亲缘关系最远。该系统树还显示出原产于四川的地方猪种(内江猪、成华猪、雅南猪、荣昌猪)与野猪的亲缘关系最近,表明这些四川地方猪种很可能就由分布于四川的野猪驯化而来。同时,采用5个野猪和其它16个哺乳动物的GH基因外显子核苷酸序列,构建了哺乳动物GH基因树,该基因树的拓扑结构与这些哺乳类物种树的拓扑结构是一致的,这表明GH基因序列适合于构建哺乳动物分子系统树。
2.野猪肌细胞生成素(Myog)基因序列的测定与分析
1)通过自行设计的引物,利用PCR技术,在1个野猪个体中获得了包括Myog基因全部外显子和内含子在内的2 466bp的MyOg基因全序列,根据Myog基因序列,cDNA全长为675 bp,MYOG整体的氨基酸总数目为224。
2)野猪Myog基因核苷酸组成富含GC(58.44%)。G+C含量较高于A+T含量(41.57%)。野猪MYOG基因全序列与其它品种猪的同源性均为99%。将该野猪Myog基因的编码序列与其它动物种类的Myog基因编码序列进行比对,同源性为:牛,92%;小鼠,90%;大鼠90%;人,93%;比目鱼,85%。
3)将所测序列与Soumillion所测猪的肌细胞生成素基因序列进行比对分析,检测到13个核苷酸突变位点,占分析位点总数的0.53%,其中4个为插入/缺失位点。
4)变异位点基本发生在内含子部分,5′端侧翼区和3′端侧翼区未检测到变异位点;第一内含子中检测到10个变异位点,占突变位点总数的76.92%;第二内含子中检测到2个变异位点;对于外显子,仅在第三外显子中检测到一变异位点,但为同义突变。
5)采用1个野猪和其它10个品种猪的Myog基因全序列,用NJ法构建了不同猪的Myog基因树。该树拓扑结构与从生长激素基因得出的拓扑结构存在着较大差异。同时,采用1个野猪和其它5个脊椎动物的Myog基因外显子核苷酸序列,构建了脊椎动物Myog基因树,此基因树的拓扑结构与这些哺乳类物种树的拓扑结构基本一致,这些结果说明相对于进行近缘品种间的系统发育分析而言,MyoG这种高度保守的基因更适合于进行远缘物种的分子系统发育树的构建研究。