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目的：制备ESAT-6多抗血清，为重组BCG疫苗融合蛋白85B-ESAT-6的表达鉴定作准备；改造pBCG2000大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体，以获得能在分枝杆菌内高效、分泌性表达的穿梭载体；构建分泌表达融合蛋白85B-ESAT-6及鼠γ干扰素的两重组卡介苗并观察它们单独及混合免疫小鼠后的小鼠抗结核病免疫反应，为进一步的动物保护性实验奠定基础。
方法：(1)利用pET原核表达系统在E.coliBL21内表达MTB的ESAT-6蛋白，Ni2+金属螯和层析纯化带有组氨酸标签的重组蛋白，用活动性结核病人血清westernblot鉴定其免疫原性。重组蛋白皮下免疫昆明鼠，westernblot鉴定产生抗体的特异性、ELISA测定抗体水平。(2)PCR扩增人MTBhsp60的上游调控序列，合成T4转录终止序列，分别定向克隆入pBCG2000载体的MCS的上下游，得到穿梭载体pBCG3000；同样地，PCR扩增人MTBAg85B编码基因的信号序列，克隆入hsp60启动子下游，得到分泌性的表达载体S-pBCG3000。(3)PCR分别扩增出MTBAg85B的全编码序列及ESAT-6基因，融合构建在pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒。以电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化入BCG细胞，SDS-PAGE电泳和Westernblotting分析重组BCG表达的融合蛋白的及其免疫学活性。(4)提取经PHA刺激的小鼠脾细胞总RNA，RT-PCR得到mIFN-γ成熟肽的编码序列并克隆至S-pBCG3000。重组质粒S-pBCG3000-γ转化BCG细胞，PCR筛选重组BCG克隆(BCG-γ)。通过ELISA测定重组BCGmIFN-γ的分泌，微量细胞病变抑制法(CPE)测定培养上清滤液中mIFN-γ的生物活性。(5)以含2×106CFU的BCG-85B-ESAT-6和BCG-γ疫苗单独和混和腹膜内单次接种BABL/c小鼠，于免疫后第4、6、8周分别对小鼠进行特异性抗体水平检测，以及抗原特异的脾细胞CK产生和增殖功能实验，脾T淋巴细胞亚群分析，以及肺部组织病理学改变等抗结核病免疫反应和疫苗致病性的观察。
结果：(1)经纯化复性后的ESAT-6融合蛋白免疫昆明鼠，于第一次免疫后第八周特异性抗体效价为1：6400。(2)大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体按预期改造完成，并在BCG内表达了融合蛋白85B-ESAT-6和mIFN-γ，目的蛋白能分泌至胞外；表达的融合蛋白85B-ESAT-6能被ESAT-6抗血清所识别，培养上清的mIFN-γ含量为1234.1pg/ml，活性可达64U/ml。(3)两重组BCG疫苗分别单独和混合接种小鼠后，小鼠肺部未出现严重的结核病特征性病理变化；BCG-85B-ESAT-6免疫组和混合免疫组有扩大的免疫效应(高抗体水平、增强的特异性淋巴细胞反应—增殖程度加强、CD8+亚群比率升高以及高IFN-γ分泌等)，BCG-γ组也一定程度增强了脾淋巴细胞特异性反应。
结论：(1)成功制备了具有一定效价的ESAT-6多抗血清。(2)大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体按预期改造完成，并成功在BCG内分泌性表达了融合蛋白85B-ESAT-6和mIFN-γ，表达的目的蛋白具有生物学活性。(3)两重组BCG接种小鼠后BCG-85B-ESAT-6疫苗和混合疫苗诱导了以Th1型为主的细胞免疫和一定的体液免疫，从而增强了小鼠的抗结核病免疫应答能力。