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白色念珠菌又称白假丝酵母菌,是一种重要的条件致病真菌,可导致皮肤、黏膜及系统弥散性念珠菌病。随着器官移植、癌症患者侵袭性治疗的普及和艾滋病患者的逐渐增加,临床上口腔和系统性念珠菌感染越来越常见。念珠菌对宿主的粘附是其致病的第一步,也是最关键的一步。明确其粘附机制,对预防及控制白色念珠菌病具有重要意义。研究发现口腔念珠菌感染患者分离的念珠菌株3683、系统感染患者血液分离的念珠菌株SC5314以及皮肤感染患者指甲分离的念珠菌株3630,在小鼠感染模型中的致病力有较大的差异,不同菌株对黏膜的粘附力和宿主的免疫应答不同可能是这种差异的原因之一。白色念珠菌ALS家族基因是其粘附相关的重要基因。而念珠菌感染后,宿主可产生细胞因子如IL-8,抵御其粘附和入侵。因此检测不同念珠菌感染后其ALS基因表达及宿主分泌细胞因子的情况,有助于阐释白色念珠菌致病力差异的原因,揭示白色念珠菌感染口腔上皮的作用机制。
目的:研究三株白色念珠菌对人口腔上皮细胞粘附能力的差异,并初步探讨这种差异产生的原因。
方法:①分别取1×107/ml三株念珠菌与1×105/ml口腔上皮细胞(包括颊上皮细胞和牙龈细胞)各0.5ml混合,37℃孵育1h,收集混合物,离心。革兰染色,镜下随机计数50个上皮细胞,计算每个口腔上皮细胞粘附的白色念珠菌数目。②三株念珠菌分别与口腔上皮细胞以10∶1的比例混合培养,6h、12h和24h收集颊细胞混合物,24h和48h收集牙龈细胞混合物,离心,去上清,保留沉淀物进行荧光定量RT-PCR实验。③三株念珠菌分别与口腔上皮细胞以1∶1的比例混合培养,6h、12h和24h收集颊细胞混合物,24h和48h收集牙龈细胞混合物,离心,收集上清,ELISA检测细胞因子IL-8、IL-12分泌量。④三株念珠菌分别与牙龈上皮细胞以10∶1的比例混合培养,分别加入IL-8(7000pg/ml)、IL-12(1000pg/ml),24h、48h时收集样本,离心,沉淀物贮存于-80℃,荧光定量PCR检测ALS1表达量。所得数据结果均用((-x)±s)表示,用SPSS统计软件进行统计学分析。
结果:①每个颊上皮细胞粘附的念珠菌数目不同,平均每个上皮细胞上粘附菌株3683为14.61±0.54,SC5314为12.55±0.53,3630为12.62±0.50,其中3683对上皮的粘附能力最强,与其余两株相比差别有统计学意义(p<0.05)。②与颊上皮细胞共培养6h后,菌株3683表达ALS1-3水平最高,分别为ALS1相对表达量82.42±19.50(p<0.05),ALS2相对表达量43.74±5.10(p<0.05),ALS3相对表达量2.13±0.61(p>0.05),3630次之,SC5314最低。随着共培养时间延长,三株念珠菌ALS1-3表达量降低。牙龈上皮细胞组ALS1-3基因表达量均低于颊上皮细胞组。③牙龈上皮细胞与三株念珠菌共培养后分泌IL-8量不同,IL-8分泌量24hSC5314组(207.07±44.60)pg/ml,3630组(142.39±9.99)pg/ml,3683组(202.63±9.36)pg/ml;48h SC5314组(262.95±27.42)pg/ml,3630组(198.81±6.98)pg/ml,3683组(267.68±10.79)pg/ml,但实验组间比较无统计学差异(p>0.05)。对照组所有时间点IL-8分泌量均高于实验组(p<0.05)。三株念珠菌与牙龈细胞共培养后IL-12分泌量各组比较均无统计学差异(p>0.05)。颊上皮细胞不分泌细胞因子IL-8/IL-12。④48h IL-8/IL-12均明显抑制念珠菌ALS1表达。加入IL-8菌株SC5314、3630和3683 ALS1表达量分别下调95.3%,79.1%,93.1%。加入细胞因子IL-12后,菌株SC5314、3630和3683 ALS1表达量分别下调50%,51.1%,70.6%,与各自同一时间点对照组比较,差异均有统计学意义(p<0.05)。
结论:①三株念珠菌对颊上皮细胞粘附力不同,菌株3683 ALS1-3表达水平最高,说明该菌株对颊上皮细胞的粘附力最强。②牙龈上皮细胞与三株念珠菌培养后,菌株表达ALS基因水平明显低于颊上皮细胞,表明念珠菌对其较弱的粘附能力,其原因可能是牙龈上皮细胞能产生IL-8抵抗念珠菌感染,但具体机制有待进一步研究。