弓形虫（Toxoplasma gondii）是世界性分布的单细胞专性寄生虫,感染人在内的几乎所有温血动物,其广泛传播不仅引起畜牧业的经济损失,也造成流行区域公共卫生安全风险。弓形虫感染宿主后可引起慢性感染,以缓殖子组成的休眠包囊寄生于宿主体内,当宿主免疫低下时,休眠包囊活化,弓形虫以速殖子的方式开始增殖,引起急性感染,严重情况下造成宿主死亡。目前虽然有药物可以控制弓形虫的急性感染,但尚未有药物可以根除宿主体内的休眠包囊。弓形虫毒力蛋白的生物学功能研究以及宿主互作机制研究是防控弓形虫感染的重要基础,弓形虫感染引起宿主细胞发生多种生理过程变化,包括细胞周期调控、细胞自噬和细胞凋亡等,宿主细胞的生理变化和弓形虫的增殖密切相关,但是弓形虫感染后宿主细胞DNA损伤的研究少见报道。细胞核DNA是遗传稳定的决定因素,而且其转录及翻译后的产物,比如RNA和蛋白质,是细胞进行各种生理过程的必需元件,因此宿主细胞DNA损伤和损伤修复的分子机制是研究弓形虫与宿主互作机制的重要组成部分。本研究首先确认了弓形虫感染引起体外培养细胞发生DNA损伤,证实活性氧自由基（Reactive oxygenspecies,ROS）是宿主细胞发生DNA损伤的重要因素;随后,本研究探究了弓形虫毒力蛋白对宿主细胞DNA损伤的影响,发现致密颗粒蛋白GRA16在细胞DNA损伤修复过程中显著减弱DNA损伤标志物γH2AX表达,阻碍DNA损伤修复过程;最后,本研究证实GRA16通过加速γH2AX去磷酸化来减弱γH2AX表达,推断PPM1D磷酸酶是γH2AX去磷酸化过程中的关键蛋白。1.弓形虫感染引起宿主细胞DNA损伤将弓形虫感染293T、HeLa和Vero细胞（MOI=10）,分别在0h（未感染）、10h、20 h和30 h取样,通过免疫印迹和免疫荧光检测宿主细胞DNA双链断裂损伤标志物γH2AX的表达水平。结果显示,与未被感染的细胞相比,弓形虫感染的3种细胞大量表达γH2AX,且随着感染时间的延长,γH2AX表达量增加,表明弓形虫感染可引起宿主细胞发生DNA双链断裂损伤。本研究随后探究了这种DNA损伤发生的可能原因,结果显示DNA损伤和宿主细胞凋亡无关;当弓形虫感染被血清封闭限制时,宿主DNA损伤程度明显下降,说明宿主DNA损伤发生依赖于弓形虫成功进入宿主细胞内建立感染;与未被感染的细胞相比,弓形虫感染的细胞ROS水平显著升高,ROS抑制剂NAC（N-acetylcysteine）处理降低宿主细胞的ROS水平并显著抑制感染后宿主细胞的γH2AX表达,说明ROS是弓形虫引起宿主细胞DNA损伤的重要因素。最后,通过免疫印迹检测了 DNA双链断裂损伤反应（DNA damageresponse）信号通路的关键蛋白ATM和CHK2,结果显示ATM/CHK2信号通路在弓形虫感染中后期被激活,提示弓形虫感染引起的宿主细胞DNA损伤可能通过激活的ATM/CHK2信号通路参与了宿主细胞周期调控等生理进程。2.弓形虫致密颗粒蛋白GRA16减弱γH2AX表达并阻碍宿主细胞的DNA损伤修复进程病原体分泌毒素或者特定毒力蛋白调控宿主细胞DNA损伤的现象普遍存在,弓形虫是否具有调控宿主细胞DNA损伤的毒力蛋白?有报道弓形虫致密颗粒蛋白GRA16定位于宿主细胞核并且和宿主磷酸酶PP2A结合紧密,PP2A磷酸酶参与了 γH2AX去磷酸化转变为组蛋白H2AX的过程,因此本章研究探究了 GRA16对宿主DNA损伤的影响。通过真核表达系统在293T细胞里过表达GRA16,免疫荧光结果显示过表达GRA16未能诱导细胞表达γH2AX,提示GRA16无法诱导细胞发生DNA损伤;GRA16无法诱导细胞发生DNA损伤,但GRA16是否参与了细胞的DNA损伤修复过程呢?本章研究运用喜树碱诱导293T细胞发生DNA损伤和损伤修复过程,实验结果显示过表达GRA16的293T细胞在DNA损伤修复过程中显著减弱了 γH2AX的表达,γH2AX的表达和细胞DNA损伤和损伤修复紧密相关,提示GRA16虽然未能诱导细胞发生DNA损伤,但是GRA16可能参与了细胞的DNA损伤修复过程;本章研究随后运用CRISPR-CAS9系统敲除弓形虫GRA16蛋白,与对照弓形虫感染的宿主细胞相比,GRA16缺失弓形虫感染的宿主细胞在感染早期高量表达γH2AX,进一步证实GRA16具有减弱宿主细胞γH2AX表达的功能;最后,通过彗星实验检测GRA16减弱γH2AX表达对细胞DNA损伤修复的影响,实验结果显示过表达GRA16的细胞在喜树碱诱导的DNA损伤修复过程中呈彗星拖尾状,提示GRA16阻碍了细胞的DNA损伤修复进程。3.宿主细胞磷酸酶PPM1D参与GRA16加速γH2AX的去磷酸化过程γH2AX的表达量在DNA损伤和修复过程中处于动态平衡,当DNA发生双链断裂损伤时,组蛋白H2AX磷酸化转变为yH2AX,当DNA损伤修复完成时,γH2AX去磷酸化转变为组蛋白H2AX。因此,GRA16减弱γH2AX表达并阻碍宿主细胞的DNA损伤修复进程有2种可能:1)GRA16抑制组蛋白H2AX磷酸化转变为γH2AX,2)GRA16加速γH2AX去磷酸化转变为组蛋白H2AX。本章研究通过免疫荧光结果证实过表达GRA16的HeLa细胞在DNA损伤早期正常表达γH2AX,后期γH2AX表达逐渐减少,提示GRA16并未抑制γH2AX的形成过程,而是加速了 γH2AX的去磷酸化过程;本章研究随后运用真核表达系统构建与磷酸酶PP2A无法结合的截短GRA16（1-237aa）蛋白,与全长GRA16（1-505 aa）蛋白相比,截短GRA16（1-237aa）依然保留了减弱γH2AX表达的功能,提示GRA16与磷酸酶PP2A的结合并未影响GRA16减弱γH2AX表达的过程;本章研究接着运用荧光实时定量PCR筛选参与γH2AX去磷酸化的3个磷酸酶（PPM1D、PPM1G和PP2A）,结果显示在喜树碱诱导的DNA损伤和损伤修复过程中,磷酸酶PPM1D在过表达GRA16的细胞里呈早期低、中期高、后期低的表达趋势,符合同期γH2AX的变化趋势,提示PPM1D可能参与了 GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程;最后,本章研究运用CRISPR-CAS9系统敲除HeLa细胞的PPM1D蛋白,与对照细胞相比,GRA16在PPM1D缺失细胞里减弱γH2AX表达的能力显著降低,进一步验证磷酸酶PPM1D参与了 GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程。综上所述,本研究从DNA损伤的角度探究了弓形虫感染对宿主细胞造成的生理变化,结果显示弓形虫感染引起宿主细胞发生DNA损伤,活性氧是宿主细胞DNA损伤的重要影响因素;弓形虫致密颗粒蛋白GRA16具有减弱宿主DNA损伤标志物γH2AX表达的功能,并阻碍了细胞的DNA损伤修复;GRA16通过加速γH2AX去磷酸化过程以减弱宿主细胞的γH2AX表达,磷酸酶PPM1D参与了 GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程。本研究探索了弓形虫感染引起宿主DNA损伤的可能因素,探究了弓形虫致密颗粒蛋白GRA16对宿主DNA损伤的调控方式,研究内容有助于进一步理解弓形虫与宿主的互作方式,为更好地防治弓形虫提供理论基础。