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研究背景三叉神经痛(TN)是临床较为常见的神经病理性疼痛之一,是在三叉神经分布区突然发生的、剧烈的、短暂的刺样、闪电样或刀割样痛。目前针对三叉神经痛的主要治疗方法有药物治疗、射频热凝、经皮球囊压迫术、立体定向放射和微血管减压术等,然而治疗效果有限。长链非编码RNA(lnc RNA)是一类不能编码蛋白的RNA,其长度大于200 bp,通过转录水平、转录后水平等方式调控基因表达。研究表明,lnc RNA在神经系统疾病以及神经病理性疼痛中发挥重要作用。此外,有研究发现lnc RNA Gm14461在脊髓神经结扎诱导的神经病理性疼痛模型小鼠背根神经节中显著高表达,提示Gm14461可能参与了神经病理性疼痛的调节。同样作为外周感觉神经节,三叉神经节与背根神经节在结构与功能上极为相似。那么,Gm14461是否也参与三叉神经痛的调节呢?目前还未有相关文献报道,这有待我们进行深入研究。降钙素基因相关肽(CGRP)是一种由降钙素基因表达的生物活性多肽,被认为是三叉神经中最重要的神经肽,当有疼痛刺激信号传入时,CGRP表达水平上升,从而降低疼痛阈值,引起三叉神经痛发作。此外,三叉神经节(TG)神经元中的P2X3受体和P2X7受体可能参与了三叉神经痛的诱发和痛觉传递过程。研究还表明炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6作用于三叉神经节、神经末梢并产生相应的炎症反应是三叉神经痛重要的机制之一。那么Gm14461是否可以调节CGRP和P2X3/7受体的表达和炎性反应呢?目前,越来越多的研究表明,在病理性疼痛状态下,C-X-C基序趋化因子12(CXCL12)在疼痛传递途径的重要部位表达。CXCL12/CXCR4轴已被发现是一种关键的促炎介质。在各种疼痛相关模型中,已发现外周神经节中CXCL12表达急剧升高,并介导神经病理性疼痛的发展。Micro RNA(mi RNA)是一类高度保守长度约为21-24个核苷酸的非编码单链RNA。mi RNA可以在转录水平上通过与靶m RNA的3’UTR结合抑制靶基因的表达。mi RNAs在神经病理性疼痛的发生和发展中起着重要作用。既往的研究表明mi R-495-3p为炎症刺激通路的负调节剂,mi R-495-3p在CFA诱导的三叉神经痛模型小鼠TG中显著下调。神经细胞过表达mi R-495-3p可明显降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平,提示mi R-495-3p参与了神经损害和神经炎症的过程。新近的研究表明lnc RNA-mi RNA-m RNA的ce RNA调控网络在神经痛的发生和发展中发挥着重要作用。Lnc RNA可以作为ce RNA结合mi RNA参与相关基因的表达和调控是其重要的分子机制之一。我们通过生物信息学预测工具发现Gm14461与mi RNA-495-3p有预测结合位点,且CXCL12是mi RNA-495-3p的潜在调控靶点。那么,Gm14461能否通过与mi R-495-3p作用靶向调控CXCL12来调节三叉神经痛?基于此,我们将通过对Gm14461在三叉神经痛中的作用进行研究,并探讨其可能的分子机制。研究目的:本研究拟分为两个部分:1.第一部分探究Gm14461对三叉神经痛模型小鼠的机械痛阈值及CGRP、P2X3/7受体和炎症因子表达的影响;2.第二部分探究Gm14461是否通过ce RNA机制来调节三叉神经痛的进展。第一部分干扰Gm14461表达减轻小鼠三叉神经痛研究方法:1.体内实验:C57BL/6J小鼠随机分为4组(n=8):假手术(Sham)组、三叉神经痛模型(TN)组、TN+scramble si RNA组、TN+si-Gm14461组。采用慢性压迫性损伤眶下神经(CCI-ION)建立三叉神经痛模型小鼠。分别在建模不同时间(0,1,3,5,7,9,11,13,15d)测定各组小鼠术侧触须垫区域的机械痛阈值。分离各组小鼠TG,q RT-PCR检测Gm14461和炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,Western blot检测CGRP、嘌呤受体P2X3、P2X7的表达水平。2.体外实验:选用4~6周龄的C57BL/6J小鼠,分离TG神经元并进行培养。分别采用TNF-α(10 ng/m L)、IL-1β(25 ng/m L)和IL-6(25 ng/m L)处理TG神经元,24h后,q RT-PCR检测Gm14461的表达水平。为了体外探究Gm14461在TNF-α处理的TG神经元中的作用,我们在TG神经元中分别转染scramble si RNA、si-Gm14461,然后采用TNF-α处理。采用Western blot检测CGRP、P2X3受体、P2X7受体的表达水平。研究结果:1.Gm14461在三叉神经痛模型小鼠TG中高表达。2.干扰Gm14461表达可以提高三叉神经痛模型小鼠的机械痛阈值。3.干扰Gm14461表达可以降低三叉神经痛模型小鼠TG中CGRP、P2X3/7受体和炎症因子的表达水平。4.细胞实验表明炎症因子刺激可上调Gm14461的表达水平。干扰Gm14461表达可以降低TNF-α诱导的CGRP、P2X3/7受体的蛋白表达。第二部分干扰Gm14461表达减轻小鼠三叉神经痛的分子机制研究方法:1.将C57BL/6J小鼠随机分为4组(n=6):假手术(Sham)组、三叉神经痛模型(TN)组、TN+scramble si RNA组、TN+si-Gm14461组。分离上述4组小鼠的TG组织,q RT-PCR和western blot检测CXCL12的表达,q RT-PCR检测mi R-495-3p的表达。2.通过RNA荧光原位杂交技术观察Gm14461的亚细胞定位。3.验证Gm14461与mi R-495-3p之间的调控关系:采用RIP和荧光素酶报告基因验证Gm14461可以与mi R-495-3p相结合。选用4~6周龄的C57BL/6J小鼠,分离TG神经元并进行培养,分别转染scramble si RNA、si-Gm14461,q RT-PCR检测mi R-495-3p的表达。4.验证mi R-495-3p与CXCL12 m RNA3’UTR的靶向调控关系:荧光素酶报告基因验证mi R-495-3p和CXCL12之间的相关性。选用4~6周龄的C57BL/6J小鼠,分离TG神经元并进行培养,分别转染mimic NC、mi R-495-3p mimic,q RT-PCR和western blot检测CXCL12的表达水平。5.C57BL/6J小鼠建模后随机分为3组(n=6):三叉神经痛模型(TN)组,TN+si-Gm14461,TN+si-Gm14461+mi R-495-3p inhibitor。测定不同时间点(0,1,3,5,7,9,11,13,15d)各组小鼠的机械痛阈值。机械痛阈值检测完成后,分离各组小鼠TG。q RT-PCR和Western blot检测CXCL12的表达水平。q RT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。研究结果:1.相比假手术组,在三叉神经痛模型组小鼠TG中,mi R-495-3p表达显著下调,CXCL12表达显著上调。干扰Gm14461表达可以降低CXCL12 m RNA和蛋白质的表达水平,同时增加mi R-495-3p m RNA的表达水平。2.Gm14461定位于细胞质,mi R-495-3p是Gm14461的靶点,TG神经元中干扰Gm14461表达可以上调mi R-495-3p的表达水平,Gm14461可以作为ce RNA调控mi R-495-3p的表达。3.mi R-495-3p可以与CXCL12 3’UTR靶向结合并负向调控CXCL12 m RNA和蛋白质的表达水平。4.mi R-495-3p抑制剂可以降低干扰Gm14461表达后三叉神经痛小鼠的机械痛阈值,增加TG中的CXCL12 m RNA和蛋白质的表达以及炎症因子m RNA表达水平,干扰Gm14461表达是通过靶向mi R-495-3p/CXCL12轴减轻小鼠三叉神经痛。全文结论:1.Gm14461介导了CCI-ION诱导的三叉神经痛的发生发展,干扰Gm14461的表达可以下调CGRP、P2X3/7受体和炎症因子的表达水平,减轻小鼠三叉神经痛。2.Gm14461可以作为ce RNA竞争性结合mi R-495-3p调节其靶基因CXCL12的表达,干扰Gm14461表达是通过靶向mi R-495-3p/CXCL12轴减轻小鼠三叉神经痛。