论文部分内容阅读
细菌、毒素和癌症对人类的安全健康有着极为重要的影响,研究并设计一系列传感方法对其检测具有重要意义。壳聚糖金纳米簇,金纳米颗粒、含金碳点等具有优良的化学及光学性质,可以将其作为癌症生物标志物及致病微生物检测的材料。利用壳聚糖的优良生物黏附性能、金纳米簇的过氧化物模拟酶性质及壳聚糖金纳米簇和含金碳点的特殊荧光性质,构建了一系列高灵敏度的可视化及荧光检测方法,实现了对肠毒素B、金黄色葡萄球菌、前列腺特异性抗原（PSA）、乳腺癌特异性抗原（CA15-3）、谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、细胞中Fe3+的检测。主要工作如下:（1）制备了具有过氧化物模拟酶性质的GNPs/Au NCs/壳聚糖复合膜,将其用于疾病生物标记物检测的免标记比色生物传感器。该生物传感器通过将催化性的GNPs/Au NCs/壳聚糖复合膜与免疫反应相结合,以调节层状纳米结构膜的过氧化物模拟酶性质,从而实现了对分析物的检测。作为可视化读数放大的检测信号,GNPs的颜色变化取决于复合膜的催化活性强弱。通过使用新的捕获探针来检测新的分析物使其功能达到扩展,可从癌症血清样品中灵敏地测定不同的癌症生物标志物,例如前列腺特异性抗原PSA和乳腺癌抗原CA15-3。这种方法的测量结果与医院采用的标准方法确定的结果非常吻合,表明该生物传感器在检测过程中具有很高的准确性,并有望在实际应用中发挥重要作用。（2）采用紫外光照射法制备壳聚糖存在下的金纳米团簇（Au NCS）,用H2O2和3’-3’-5’-5’-四甲基联苯胺（TMB）测试其过氧化物模拟酶性质。Au NCS-壳聚糖复合膜也具有过氧化物模拟酶性质,用TEM、AFM和SEM对其进行了表征,结果表明形成的膜是均匀的,Au NCS呈球状且分散良好,在膜中无团聚。结合模拟Au NCS-壳聚糖复合膜的免疫反应,建立了不同颜色的金纳米颗粒作为输出信号的比色法。选择金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等三种细菌作为模型菌,评价该传感器对金黄色葡萄球菌的选择性。这种比色传感是一种可扩展的策略,因为探针的识别元件可以在催化性的Au NCS-壳聚糖复合膜上替代。金黄色葡萄球菌肠毒素B（SE-B）检测限低至1.0×10-12g/m L,并可通过肉眼读出。所开发的比色法被用于金黄色葡萄球菌的快速现场筛选策略,并在食品样品中检测SE-B。这种比色法为在食品安全和环境监测中现场快速筛选病原菌和检测肠毒素提供了平台。（3）谷胱甘肽（GSH）在生物系统中起着多种重要作用。细胞中GSH浓度与生长相关的变化可能对细胞存活至关重要,而活细胞中GSH的监测对于了解GSH与某些疾病之间的动态联系具有重要意义。在这项工作中,用简单,快速的方法制备了发出红色荧光的壳聚糖金纳米团簇（CM-Au NCs）,壳聚糖胶束尺寸的改变引发了聚集诱导荧光（AIE）现象的逆过程。基于GSH诱导的CM-Au NCs的AIE逆过程,采用独特的CM-Au NCs开发了用于检测人血清和活细胞中GSH的荧光探针,可以将GSH与其他生物硫醇（半胱氨酸和高半胱氨酸）区分开来,并可以高灵敏度定量检测健康人和癌症患者血清中GSH的浓度。荧光CM-Au NCs在细胞成像和检测GSH浓度中的实际应用不仅监测了细胞中GSH浓度的超痕量变化,而且可以监测不同生长阶段的细胞,发现癌细胞中GSH的浓度始终较高。相对于用于检测人血清和活细胞中GSH的商用GSH分析试剂盒相比,该方法具有较高的准确性和精密度。实验结果不仅反映了细胞生长过程中不同阶段谷胱甘肽的浓度变化,而且证明了CM-Au NCs AIE逆过程检测谷胱甘肽的可行性,为了解GSH的动态变化与疾病之间的关系提供一个研究平台。（4）包括谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸在内的生物硫醇的变化与多种疾病和细胞功能密切相关。实时监测活细胞中细胞内GSH和半胱氨酸的动态变化对于了解病理生理过程很重要。在这项研究中,制备了由碳骨架和金纳米团簇组成的荧光含金碳点（GCDs）,它发出蓝色荧光。所制备的GCDs的蓝色荧光对包括谷胱甘肽和半胱氨酸在内的生物硫醇没有响应,但是伴随着生物硫醇与GCDs的反应会出现红色荧光,因此可以基于GCDs建立比色荧光生物成像检测活细胞中的GSH和半胱氨酸水平。此外,实现了对处于不同生长阶段的活细胞中GSH和半胱氨酸浓度的实时监控。发现癌细胞中GSH的浓度高于正常细胞,但是正常细胞中半胱氨酸的浓度始终高于癌细胞在不同生长阶段的半胱氨酸浓度。由于具有实时定量GSH和半胱氨酸的能力,荧光GCDs探针为跟踪GSH和半胱氨酸提供了有希望的平台。（5）铁死亡是铁依赖的受调节细胞死亡的形式,当谷胱甘肽依赖的脂质过氧化物修复系统受到破坏时,基于脂质的活性氧（ROS）的致死性积累导致铁死亡。铁死亡引起的细胞死亡在形态、生物化学和遗传学方面与其它死亡形式（如凋亡,坏死和自噬）表现不同。尽管铁死亡在维持正常细胞和组织的存活中起着重要作用,但人们日益认识到某些致癌途径与铁死亡有关,使癌细胞极易遭受铁死亡导致的死亡。采用微波辅助加热法成功制备了荧光GCDs,GCDs具有优良的抗光漂白性,并且其荧光对硫醇化合物的检测具有可逆性,包括GSH和半胱氨酸的定量以及实时进行细胞内生物硫醇含量变化的荧光成像。GSH-GCDs的荧光不再对生物硫醇有响应,但Fe3+对其荧光有着明显的猝灭作用,利用此性质我们实时检测了在癌细胞铁死亡过程中细胞内Fe3+含量的定量变化,并对其进行了细胞成像。结果表明,GCDs可以实时跟踪癌细胞铁死亡过程中细胞内生物硫醇变化和铁代谢,在癌细胞铁死亡过程中,细胞内的硫醇化合物含量随之减少,而Fe3+含量随之增加。