目的肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是肺炎、脑膜炎和中耳炎的主要病因,也是引起全世界范围内婴幼儿、老年人和免疫缺陷个体疾病的主要病原菌。随着耐药菌株的不断发现,疫苗在其感染防治中的作用越来越重要。目前,所用的主要是23价肺炎多糖疫苗和7价结合疫苗,前者覆盖的血清型有限而且不是T细胞依赖性的,对免疫系统发育不完善的2岁以下小孩和老年人的保护性弱;后者存在荚膜血清型转换和载体携带的荚膜多糖血清型数量有限以及在肺炎高发人群中的保护作用小等问题,并且生产成本很高,不适合在发展中国家大量使用。S.pn根据荚膜分为90多个血清型,开发对所有血清型S.pn都起抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前S.pn疫苗的发展方向。近年来发现的S.pn蛋白质侯选疫苗ClpP(caseinolytic protease P, ClpP)是ATP依赖的丝氨酸蛋白水解酶,其在S.pn的生存、致病和入血过程中起着重要的作用,针对其靶点的疫苗或抗生素越来越显示出其潜在的价值。本研究旨在探讨ClpP在不同S.pn菌株中的基因序列保守性、在不同血清型S.pn中表达情况,并进一步验证含有ClpP活性成分的疫苗能否抵抗不同型别的肺炎链球菌的侵袭性感染,以明确ClpP蛋白疫苗的保护范围,为自主开发S.pn蛋白疫苗奠定基础。方法1.检测12株S.pn细菌中的ClpP基因以TIGR4型S.pn的ClpP基因序列设计引物,分别以12株不同血清型S.pn的基因组DNA为模板,对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD-18克隆载体连接后进行测序,利用DNAssist软件,将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与Gene Bank数据库对已公布的TIGR4肺炎链球菌全基因组序列进行相似性分析。2.Western Blot检测ClpP蛋白的表达将12株S.pn从C+Y培养基中收获后,用PBS洗3次,用1×上样buffer处理,再于100℃水浴5 min。全菌裂解物经SDS-PAGE电泳分离后转膜。以anti-ClpP多克隆抗体为一抗(1:400),羊抗鼠HRP-IgG为二抗(1:5000),DAB为显色底物,Western Blot检测菌体中ClpP蛋白的表达。与此同时,以金黄色葡萄球菌作为对照。3.主动免疫保护实验将含有重组质粒pET32a(+)/ClpP工程菌BL21(DE3)经IPTG诱导后表达ClpP蛋白,经纯化后与铝佐剂混合后经腹腔注射免疫小鼠,而对照小鼠则用PBS与铝佐剂混合后进行免疫。免疫程序:分别于0天、14天、28天将重组蛋白与铝佐剂(Inject Alum购于Pierce)1:1混合后经腹腔注射免疫组小鼠;同时用PBS与铝佐剂1:1混合后经腹腔注射对照组小鼠,每只200μl。初次免疫5周后用ELISA法测小鼠针对ClpP蛋白的抗体免疫应答水平,末次免疫2周后用12个型别S.pn攻击,监测其生存时间。4.抗体被动免疫保护实验在攻击BALB/c小鼠之前,兔抗体被纯化。12株肺炎链球菌在C+Y培养基中培养至对数生长期,每一株细菌菌液各2ml分别与anti-ClpP特异抗体和非特异血清混合,于4℃过夜。次日两种血清处理的10μl菌液置于玻片上用显微镜下观察。剩下的菌液分别攻击经过随机分组的小鼠,各12只,每只小鼠经腹腔接受100μl的菌液,连续检测小鼠的生存状态至第7天,各组小鼠的半数生存时间用Mann-Whitney U进行统计学分析,各组小鼠的生存率用Fisher精确统计学方法进行分析。结果1.以12个血清型S.pn DNA为模板用编码ClpP蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增,结果12个PCR产物电泳后出现大小一致,单一的条带。将这些PCR产物与PMD-18T进行亚克隆后,经双向测序不同株的ClpP基因编码区大小与TIGR4菌株中ClpP基因一样,均为591 bp,基因序列一致性超过99%。由于遗传密码子的简并性,预测的氨基酸序列一致性则为99.5%以上。2.利用Western Blot方法检测12株不同血清型S.pn的ClpP蛋白的表达。S.pn全菌裂解物经电泳分离后,与制备的anti-ClpP血清反应,12型S.pn全菌裂解物均在约21kD的位置出现特异性反应条带,而阴性对照未见反应条带出现。该结果提示了12个型别S.pn中均有ClpP蛋白抗原的表达。3.Trx-ClpP融合蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠产生高滴度的抗体后,末次免疫2周后,12个型别S.pn经腹腔感染小鼠后。各组小鼠生存时间和生存率经统计学分析后,免疫组小鼠的中位生存时间与对照组小鼠中位生存时间有统计学意义(P<0.05),免疫组小鼠的中位生存时间明显延长,两者生存率相比也具有显著的统计学意义(P<0.05)。该结果表明ClpP融合蛋白免疫小鼠后可产生针对多个血清型S.pn的保护性免疫。另外,我们以免疫后14天的间隔时间取小鼠血用ELISA法测定anti-ClpP的效价,抗体效价至少维持了98天。4.12株S.pn能与anti-ClpP混合后能出现凝集,与非特异血清混合无凝集现象出现。用anti-ClpP特异抗体处理的S.pn攻击小鼠,与非特异血清处理的同株S.pn攻击小鼠的生存时间相比较,中位生存时间明显延长,观察期末小鼠的生存率也明显提高,具有显著的统计学意义。结论1.不同血清型肺炎链球菌的ClpP的DNA序列和蛋白序列高度保守。2.不同血清型肺炎链球菌ClpP基因编码的蛋白均有表达。3.用含有ClpP活性成分的疫苗免疫小鼠后,小鼠产生了高滴度的抗体,并且小鼠能抵抗不同型别的S.pn的侵袭性感染,进一步验证了ClpP蛋白疫苗的保护范围不受血清型限制的。而且小鼠体内anti-ClpP抗体滴度水平维持时间长。4.抗ClpP的多克隆血清能够与完整的S.pn进行结合,并且能够保护BALB/c小鼠抵抗12株S.pn的致死剂量的攻击。