植物的线粒体对新陈代谢和多种生物合成途径都发挥重要作用,其中氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)途径能够满足植物细胞生长发育的需求。在这过程中,电子依托分布于线粒体内膜中的一系列呼吸复合物(Ⅰ-Ⅳ)参与氧化还原反应完成电子传递,并释放能量驱动ATP合成。但是由于呼吸复合物Ⅰ-Ⅲ存在的电子泄漏现象,电子传递所消耗的氧的0.2%-2%并没有形成H20而是形成了活性氧(reactive oxygen species,ROS),例如超氧化物阴离子和过氧化氢(H2O2)等。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)就是植物细胞中清除H2O2的主要酶之一。拟南芥的研究表明线粒体和叶绿体的ROS水平是通过双定位于这两个细胞器的叶绿体基质型抗坏血酸过氧化物酶(sAPX)共同调控的,此外还有细胞质抗坏血酸过氧化物酶(cAPX)通过交叉保护机制予以辅助。然而,木本植物中线粒体的ROS水平调控机制还不够清晰。本研究通过讨论毛白杨PtomitAPX亚细胞结构定位的特异性;qRT-PCR分析了PtomitAPX的表达模式;观察转基因植株和细胞形态学缺陷探讨PtomitAPX在植物生长发育过程中的主要作用;通过激光共聚焦显微镜观察该基因对线粒体功能以及线粒体ROS水平的影响;同时,体外检测分离的高纯度线粒体其氧化程度、H2O2含量、非酶还原剂含量、ATP含量以及呼吸复合物活性;通过流式细胞仪检测转基因悬浮细胞系的细胞凋亡程度;通过比较分析野生型和转基因细胞系的转录组数据,进一步探究该基因在植物抗氧化系统和生长发育过程中的地位,为深入揭示植物线粒体抗氧化机制奠定重要的工作基础。本研究得到了以下主要研究结果:1.PtomitAPX和PtosAPX信号肽二级结构的比较分析结果表明,二者信号肽N端前19个氨基酸存在显著差异;PtomitAPX的信号肽具有线粒体定位特征:富含正电荷氨基酸,且这些正电荷氨基酸聚集在α螺旋中;而PtosAPX信号肽有叶绿体特征:只有一个正电荷氨基酸,且信号肽N端前19个氨基酸没有α螺旋。2.本研究分别使用过氧化氢胁迫、盐胁迫、高温胁迫、干旱胁迫、低温胁迫以及强光胁迫处理野生型毛白杨组培植株,然后通过qRT-PCR对PtomitAPX、PtosAPX和PtotAPX的表达模式进行分析。本研究发现,PtomitAPX能够响应氧化、盐和高温胁迫的刺激,而PtosAPX主要响应强光胁迫;在酶动力学的研究中发现PtomitAPX与PtosAPX的活性没有显著差异;而使用ELISA分别检测线粒体中APX含量发现PtomitAPX含量显著高于PtosAPX。这部分结果表明,PtomitAPX是线粒体中发挥主要作用的APX,并且PtosAPX的表达模式与chlAPX相似而PtomitAPX的表达模式具备线粒体特征。3.反义转基因植株出现了严重的生长障碍,过表达转基因植株也出现了轻微的生长迟缓并需要额外的6-BA才能正常生长;使用激光共聚焦显微镜观察线粒体的结果表明,反义和过表达转基因植株的线粒体形态异常、膜电位差下降。4.反义和过表达转基因悬浮细胞均出现不同程度的生长迟缓现象;通过透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜的结果发现反义转基因细胞的线粒体形态异常、膜电位差下降、丧失运动能力、ATP含量减少、呼吸复合物活性降低,通过激光共聚焦显微镜和线粒体生理检测的结果发现线粒体中ROS爆发、氧化程度增加,表明反义转基因细胞的线粒体结构和功能异常是由于线粒体遭受氧化损伤造成的;过表达转基因细胞线粒体结构和功能也异常、线粒体ATP含量降低、线粒体呼吸复合物活性相比野生型没有显著差异,表明过表达转基因细胞的线粒体结构和功能异常是由于H202含量匮乏引起的;外源AsA和H202的加入分别使反义和过表达转基因悬浮细胞其线粒体结构和功能的异常现象发生缓解;使用流式细胞仪检测转基因细胞凋亡发现,反义转基因细胞系的活细胞数量在未处理条件下相比于野生型有显著减少,外源H202可以加剧此现象,而外源AsA可以部分缓解这一现象;过表达转基因细胞系的活细胞数量始终保持高水平(≥98%)。5.转录组的分析结果表明,未处理条件下反义和过表达转基因细胞系中大量磷酸化过程相关基因表达量下调,表明PtomitAPX表达量的变化对线粒体功能造成了影响;反义转基因细胞系经过AsA处理后磷酸化过程有显著恢复,而过表达转基因细胞系经过H202处理后得到了显著恢复。本研究表明,PtomitAPX作为重要的、不可被替代的控制者,对线粒体的H2O2含量实现精确调控以维持活性氧平衡,该酶的适量表达是必须的,表达量过高或过低都会导致线粒体结构和功能受到不同程度的损伤,进而影响植物的生长发育。