第一部分TNFα诱导蛋白-3（A20）在肝癌发生和转移中的作用及机制研究研究背景和目的炎症和肿瘤存在密切关系，据研究许多肿瘤的发生如结肠癌、胃癌、胰腺癌等都与慢性炎症有关，肝癌也是如此。中国是肝癌发生率较高的国家，据统计世界上50%以上的肝癌发生在中国。而我国肝癌的发生主要原因是乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性肝炎，慢性乙肝诱发的肝癌占全体的60%以上。因此，控制炎症的发展对于许多肿瘤包括肝癌的防治都具有十分重要的意义。细胞内有许多炎症相关信号通路，其中，NFκB转录因子的激活是非常关键的炎症信号，它的激活会促进许多炎性因子的转录表达，如TNFα，IL-1，IL-6，IL-8等等，在小鼠模型和人类的研究中都已证实这些炎性细胞因子与肿瘤的发生密切相关；肝脏中相关研究也证实，肝细胞中IKK/NFκB信号的激活通过维持肝脏的炎症反应促进肝癌的发展，肝脏中kuffer细胞中IKK/NFκB的活化同样促进肝癌发展，而在肝细胞和kuffer细胞敲除IKKβ之后，炎症因子IL-6及TNFα的产生明显减少，肝脏代偿性增殖以及二乙基亚硝胺（N-Diethylnirtosamine，DEN）诱导的肝癌发生被显著抑制。因此，抑制NFκB的活性有利于控制肝癌的发生发展。TNFα诱导蛋白-3，又称作A20，由TNFα，IL-1，LPS等多种细胞因子通过激活NFκB，启动A20基因转录而表达。A20通过其N端的去泛素化可以抑制NFκB通路中接头蛋白如RIP1，TRAF6，NEMO等的功能，并通过其C端的泛素化活性促进RIP1的泛素化降解，从而抑制IKK的活性，之后抑制NFκB的激活。A20在对炎症免疫系统的调控中发挥重要作用，其基因存在很多单核苷酸多态性（SNP）位点，这些SNP与许多自身免疫性疾病如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，银屑病，克隆氏病等密切相关。关于A20在肿瘤中的研究目前主要是在淋巴瘤中，在淋巴瘤的发生中，NFκB的过度激活十分重要，在多种淋巴瘤中广泛存在A20基因突变而导致的失活。尽管已有许多关于A20在炎症免疫及淋巴瘤中的研究，但是在肝脏中对于A20功能的研究目前还非常少，有研究报道，在半乳糖苷/脂多糖诱导小鼠急性致死性肝炎模型中，通过腺病毒在肝细胞中过表达A20能够提高小鼠存活率，然而，对于在慢性肝炎以及肝癌的发生发展过程中A20具有什么样的功能目前还不清楚。本研究旨在通过大鼠DEN诱导肝癌模型观察A20在肝脏慢性炎症发生发展并向肝癌转化过程中的变化，并通过A20肝细胞特异性敲除小鼠DEN/CCL4（四氯化碳）诱导肝癌模型研究肝细胞A20缺陷对肝癌发生的影响，此外，利用人肝细胞癌组织芯片进行A20免疫组化染色结合临床资料进行分析，了解A20蛋白的表达与人肝细胞癌增殖、转移、复发的关系以及对肝癌预后的影响。实验方法1.通过DEN腹腔注射诱导Sprague-Dawley大鼠肝癌的动物模型，观察A20在DEN诱导的慢性肝炎-肝癌过程中A20的表达变化，以及与血清中炎症因子TNFα和肝脏中NFκB活性变化的关系，确定在肝炎及肝癌中A20对NFκB的抑制作用。2.分别在mRNA水平和蛋白水平通过realtime-PCR和western blot及免疫组化检测在人肝癌以及癌旁组织中A20的表达，以了解A20的基本表达水平。3.利用包括143例肝癌及癌旁的人肝癌组织芯片进行A20免疫组化染色，结合肝癌病例资料，分析A20与肝癌患者预后以及肿瘤大小、肿瘤分期、转移、癌栓形成、肿瘤复发等临床特征之间的关系，并对有统计学差异的在细胞水平进行进一步研究。4.通过带有真核抗性的A20过表达质粒和A20干扰质粒转染之后加嘌呤霉素筛选建立稳定细胞系，再通过CCK-8细胞增殖实验，细胞周期实验以及裸鼠皮下成瘤实验观察A20对于肝癌细胞增殖的影响。5.通过A20的稳定细胞系进行细胞划痕、穿膜及侵袭实验，对A20对肝癌细胞迁移的影响进行观察，并通过研究A20对细胞骨架蛋白Rho家族、细胞迁移相关蛋白基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）家族及上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关基因的影响，对A20影响肝癌细胞转移的机制进行研究。6.利用肝细胞特异性敲除A20的小鼠及野生型小鼠，通过DEN/CCL4腹腔注射诱导小鼠发生肝癌，观察A20敲除小鼠与野生型小鼠之间在肝癌发生时间、肝癌产生数量及大小的区别，从而能在体内研究A20对于肝癌发生的影响。实验结果1. DEN诱导肝癌过程中大鼠肝脏A20的表达随炎症的进展而逐渐增多，并能够抑制NFκB的活性。2.大多数人肝癌组织中A20的表达水平较低，少数病例肝癌组织A20表达较强，而正常的癌旁组织中A20表达极低。3. A20在肝癌组织中的表达与肝癌患者的总体生存期及无瘤生存期呈正相关。4. A20在肝癌组织中的表达与肿瘤大小、分期、转移及癌栓形成都呈负相关。5. A20的表达能够通过抑制NFκB降低CyclinD1的活性，从而阻滞细胞周期，抑制肝癌细胞的增殖，并能够抑制肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤性。6. A20在肝癌细胞中的表达能够抑制肝癌细胞体外及体内的迁移能力、侵袭能力。其机制与A20对EMT相关基因Twist1的表达的抑制有关。7.在肝细胞特异性敲除A20的小鼠中，DEN/CCL4诱导的肝癌更多，体积更大，肝脏组织中NFκB的活性更强，说明A20能够抑制慢性肝炎及肝癌的发生。结论本研究通过动物体内肝癌诱导模型及人类肝癌病例分析发现，A20通过其对NFκB的负向调控，参与调节肝癌细胞增殖、转移，对肝癌的发生发展起着重要的抑制作用。此外，A20的表达水平与肝癌患者预后的正相关说明A20可以作为判断肝癌预后的一项指标。第二部分肿瘤干细胞标志物CD133蛋白在肝癌中的功能研究研究背景和目的肝细胞癌是全球发生率第5且男性中死亡率第2的肿瘤，占肝癌的百分之七十五到百分之八十，而其中一半以上的肝细胞癌发生在中国，而且由于很大一部分诊断较晚，对化疗药抵抗以及复发率高而预后较差，生存期短。解决肝癌化疗耐受及复发是肝癌治疗的关键所在。近年来许多研究表明肿瘤中存在着一部分肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs），它们不仅关系着肿瘤的产生和进展，而且具有干细胞的特性，即可以自我更新产生新的干细胞同时可以通过分化产生不同表型的成熟细胞，目前在多种肿瘤包括肝癌中发现了肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展中起着关键性的作用，它们与分化的肿瘤细胞在许多生存代谢功能方面存在很多差异，正是由于这些差异使普通的化疗疗法不能有效的杀死肿瘤干细胞，使肿瘤发生耐药和复发。因此，发展针对肿瘤干细胞的疗法是治疗肿瘤的有效途径，而识别肿瘤干细胞并了解其功能是首要前提。自噬（autophagy）是细胞在饥饿以及应激情况下出现的一种代谢过程，通过形成自噬泡将细胞内的一些错误蛋白、损坏的细胞器以及一部分胞浆包裹并与溶酶体结合进行降解之后进入再循环。正常组织中自噬的缺陷与肿瘤的发生相关，但是在肿瘤细胞中，自噬却又通过抑制炎症、坏死和基因组损伤来保护代谢应激下的肿瘤细胞作用，对于肿瘤细胞的生存代谢具有十分重要的意义。细胞表面标志性蛋白是识别肿瘤干细胞的有效方法，其中，细胞膜蛋白CD133，又称Prominin-1，在许多肝癌研究中被认为是肿瘤干细胞的标志物，从肝癌中分离出的CD133阳性细胞具有自我更新能力及更强的克隆形成能力，能够多向分化，在动物体内的成瘤性更强，因此CD133阳性的肝癌细胞被认为是肝癌干细胞。然而，对于CD133蛋白本身具有什么功能研究并不多，仅有研究报道CD133膜蛋白与细胞膜上的胆固醇相互作用参与细胞膜结构的构建以及CD133蛋白可以调节转铁蛋白的摄入从而参与细胞中的铁的代谢，这些结果也说明CD133蛋白本身对于细胞的生存代谢具有一定的功能，其功能或许与CD133阳性肿瘤干细胞的特性相关，对于CD133蛋白功能的研究有利于促进对肿瘤干细胞的进一步了解，也利于我们对靶向肿瘤干细胞治疗策略的研究。本课题的目的在于研究CD133蛋白在肝癌细胞自噬及生存代谢中的功能，并通过CD133单克隆抗体靶向CD133作用于肿瘤干细胞，来了解CD133蛋白对于肝癌中肿瘤干细胞的作用及意义，从而促进靶向肿瘤干细胞的研究以利于肝癌的治疗，改善肝癌患者的预后。实验方法1.观察CD133单克隆抗体（CD133mAb）对肝癌细胞的作用：分别用CD133单克隆抗体（美天旎）和同型对照mouse IgG1在正常培养基和低糖培养基环境下处理细胞，之后观察以下内容：(1)对细胞生存的影响：CCK8实验；显微镜观察；(2)对细胞凋亡的影响；(3)对细胞裸鼠皮下成瘤性的影响；(4)对细胞自噬的影响：LC3-GFP转染并计数自噬颗粒；western blot观察LC3-II。2.观察CD133蛋白对细胞自噬水平的影响：(1)建立CD133差异表达细胞系：Huh7细胞通过CD133-shRNA病毒感染后嘌呤霉素筛选建立稳定干扰CD133细胞系，LM3细胞通过转染CD133质粒及嘌呤霉素筛选建立稳定过表达CD133细胞系；(2)将CD133差异表达的细胞经过饥饿（低糖DMEM）处理特定时间后收蛋白进行定量后蛋白电泳，杂交LC3，观察LC3I-LC3II的表达变化；(3) CD133差异表达的细胞经转染LC3-GFP质粒后，经饥饿处理特定时间后观察细胞中GFP自噬颗粒并计数进行比较；(4)细胞经瞬转CD133表达后，进行细胞免疫荧光染色，共染CD133(Cherry)和LC3（GFP），比较CD133阳性细胞与CD133阴性细胞中LC3-GFP颗粒的数量，同时可以观察CD133蛋白是否与自噬小体共定位；(5)通过透射电镜观察细胞内的自噬小体，比较CD133蛋白表达的差异对自噬小体形成的影响；(6)分选稳定细胞系中CD133阳性与CD133阴性细胞，对它们的自噬水平进行比较。3.观察CD133蛋白与溶酶体之间的关系：(1)在将细胞固定在玻璃皿壁上之后，通过溶酶体膜蛋白CD107a的染色观察溶酶体的定位，并通过共染色了解CD133的降解与溶酶体之间的关系；(2)在活细胞中，我们将利用溶酶体染料（lysotracker, Invitrogen）对溶酶体进行标记，同时转染GFP标记的CD133，对二者的关系进行连续的实时观察。4.人肝癌组织原代细胞的分离：取手术后新鲜肝癌组织经清洗后，IV型胶原酶消化20分钟，过滤后收集细胞，并以磁珠分选的方法分离CD133高表达及CD133低表达的细胞群。5.观察CD133对肝癌细胞ATP的影响：利用promega公司的ATP检测试剂盒检测ATP，了解CD133对于肝癌细胞能量代谢的调节作用。6.观察CD133对肝癌细胞增殖、生存能力及成瘤性的影响：CCK8及NOD-SCID小鼠皮下荷瘤实验。实验结果1. CD133抗体可以诱导肝癌细胞在低糖条件下死亡；2. CD133抗体可以抑制肝癌细胞的自我更新、化疗抵抗及动物体内成瘤能力；3. CD133抗体引起细胞死亡的方式不同于细胞凋亡；4. CD133抗体抑制肝癌细胞的自噬；5.过表达CD133蛋白促进肝癌细胞自噬；6.干扰CD133蛋白表达抑制肝癌细胞自噬；7. CD133蛋白直接参与自噬过程；8. CD133蛋白参与调控肝癌细胞中的ATP合成；9. CD133蛋白促进肝癌细胞的生存及动物体内成瘤性；结论在本研究中，通过CD133单克隆抗体（CD133mAb）对肝癌细胞系的处理发现低葡萄糖的培养环境能够增强CD133mAb诱导肝癌细胞死亡的作用，CD133mAb的这种作用是由于它抑制了肝癌细胞在低糖环境下的自噬水平。而且CD133蛋白在肝癌细胞中的高表达能够增强肝癌细胞在低糖环境下的自噬，并利于肝癌细胞在饥饿环境下的生存和对化疗药物的耐受。