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内蒙古阿尔巴斯绒山羊是内蒙古自治区一种绒肉兼优的山羊品种,尤其是所产羊绒具有“软黄金”之称。毛囊（hair follicle,HF）是一种皮肤附属器官,在绒山羊中HF有初级和次级之分,其中初级毛囊可以生长出羊毛,次级毛囊则生长出羊绒。位于HF底部的毛乳头细胞（dermal papilla cells,DPC）是毛囊中最重要的细胞类型之一,具有调控毛发周期和维持毛发生长的作用。低氧作为一种在动物体内广泛存在的微环境,具有促进细胞增殖、延缓细胞衰老和提高再生潜能的作用。Hippo信号通路是一种在干细胞中有较高活性的通路,该通路在调节动物器官大小、限制细胞的增殖以及诱导细胞凋亡等方面发挥着关键性的作用。MicroRNA（miRNA）是一种高度保守的,由18-25个核苷酸组成的短序列非编码RNA,广泛存在于动物体内。有研究表明miRNA参与了低氧微环境和Hippo信号通路的调控网络作用,但miRNA-Hippo信号通路在低氧微环境中的调控机制尚不清楚。本研究采用内蒙古阿尔巴斯绒山羊的初级毛乳头细胞（primary dermal papilla cells,PHF-DPCs）和次级毛乳头细胞（secondary dermal papilla cells,SHF-DPCs）为实验材料,分别使用常氧、物理低氧、化学低氧模拟物25μM DFO、化学低氧模拟物150μM CoCl2这四种处理方式处理后开展了以下研究:1、处理时间的筛选本研究中使用上述四种处理方式分别对PHF-DPCs和SHF-DPCs处理24h、48h、72h后,用CCK-8试剂进行检测,结果显示PHF-DPCs和SHF-DPCs使用上述四种处理方式处理48h后细胞活性最好。2、毛乳头细胞种类的鉴定以及低氧环境的鉴定PHF-DPCs和SHF-DPCs在四种处理方式处理后,对DPC特异性表面标记蛋白CD133和α-SMA进行免疫荧光检测,结果显示均为阳性,证明本次实验中所用的细胞确实为PHF-DPCs和SHF-DPCs,且低氧处理不会改变细胞类型。为确定低氧环境是否建立成功,本研究采用Western Blot对低氧诱导因子HIF-1α在蛋白水平的表达进行了检测。结果显示,PHF-DPCs和SHF-DPCs在四种处理方式处理后HIF-1α的表达量较常氧均有所提高,该结果证明低氧环境构建成功。3、细胞凋亡检测为检测上述四种处理方式对PHF-DPCs和SHF-DPCs细胞凋亡的影响,本研究采用流式细胞术进行凋亡检测。结果显示,PHF-DPCs和SHF-DPCs在物理低氧、化学低氧模拟物25μM DFO、化学低氧模拟物150μM CoCl2处理48h后凋亡晚期和死细胞所占比率较常氧均有所减少,而早期凋亡的细胞所占比率有所增多,证明低氧能有效延缓细胞凋亡。4、细胞凋亡相关基因和细胞标志性基因检测本研究对PHF-DPCs和SHF-DPCs使用上述四种处理方式分别处理24h、48h、72h后,首先采用实时定量PCR对凋亡基因p53、Bcl-2、Bax进行检测。结果显示,处理48h后p53的表达量均要低于24h和72h,Bcl-2/Bax的比值均高于24h和72h,且物理低氧、化学低氧模拟物25μM DFO、化学低氧模拟物150μM CoCl2处理后p53的表达量均要低于常氧,Bcl-2/Bax的比值均要高于常氧。对上述四种处理方式处理48h的PHF-DPCs和SHF-DPCs中凋亡相关基因进行Western Blot检测,结果与实时定量PCR结果基本一致。随后采用实时定量PCR对细胞标志性基因Sox2、ALP、α-SMA进行检测,结果显示处理48h后,Sox2、ALP、α-SMA的表达量均要高于24h和72h,且物理低氧、化学低氧模拟物25μM DFO、化学低氧模拟物150μM CoCl2处理后Sox2、ALP、α-SMA的表达量均要高于常氧。对上述四种处理方式处理48h的PHF-DPCs和SHF-DPCs中标志性基因进行Western Blot检测,结果与实时定量PCR结果基本一致。证明低氧可以促进PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖活性。5、Hippo信号通路关键基因检测用上述四种处理方式处理PHF-DPCs和SHF-DPCs 48h后,通过Western Blot检测Hippo信号通路关键基因检测Lats2和YAP的表达量。结果显示,PHF-DPCs和SHF-DPCs通过物理低氧、化学低氧模拟物25μM DFO、化学低氧模拟物150μM CoCl2处理后YAP的表达量较常氧均有所提高,Lats2的表达量均有所下降。该结果证明Hippo信号通路在低氧促进PHF-DPCs和SHF-DPCs增殖的过程中发挥作用。6、MicroRNA的筛选及验证首先通过网站预测Lats2可能的靶向miRNA,并通过实时定量PCR在上述四种处理方式处理48h后的PHF-DPCs和SHF-DPCs中进行验证。结果显示,物理低氧、化学低氧模拟物25μM DFO、化学低氧模拟物150μM CoCl2处理48h后miR-25-3p和miR-107-3p的表达量较常氧均有所提高。随后构建含有Lats2基因3’UTR的pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector重组质粒载体,通过双荧光素酶报告系统初步判断miR-25-3p和miR-107-3p与Lats2有靶向相关性。最后通过Western Blot检测,结果显示miR-25-3p mimics和miR-107-3p mimics组的表达量较NC mimics组均有所下降,该结果证明miR-25-3p和miR-107-3p均为Lats2的靶向miRNA。上述结果表明:低氧通过miR-25-3p和miR-107-3p共同抑制Lats2导致PHF-DPCs和SHF-DPCs增殖活性提高。本研究发现了miRNA和Hippo信号通路在低氧促进DPC增殖中的途径,为今后相关研究的不断深入提供了实验依据。该结果对于毛囊再生生物学的研究以及理解低氧的作用机制具有重要的意义。