【摘 要】
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龋病(Dental caries)作为一种常见的慢性口腔疾病,对人们的生活及工作造成了严重的影响。其中低龄儿童龋病(Early Childhood Caries,ECC)以发病对象年龄小(3-6岁)、发病率高等特点对幼儿的身心发育及美观造成影响。口腔生态学理论认为ECC主要与口腔菌群的失衡相关,且某些菌属可作为ECC的关键菌属,这为ECC的早期检测和治疗提供理论基础。针对ECC的治疗,有研究表明益
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龋病(Dental caries)作为一种常见的慢性口腔疾病,对人们的生活及工作造成了严重的影响。其中低龄儿童龋病(Early Childhood Caries,ECC)以发病对象年龄小(3-6岁)、发病率高等特点对幼儿的身心发育及美观造成影响。口腔生态学理论认为ECC主要与口腔菌群的失衡相关,且某些菌属可作为ECC的关键菌属,这为ECC的早期检测和治疗提供理论基础。针对ECC的治疗,有研究表明益生菌可作为一种外源的细菌补充剂,通过调节口腔菌群组成,抑制一些细菌的增长以达到预防与治疗ECC的目的。本研究通过采集ECC儿童的龋损部位与健康部位的牙菌斑,以健康儿童牙菌斑为对照,探寻不同健康状态的儿童口腔菌群特征,并筛选出不同健康状态的关键菌属。针对这些菌属差异,为ECC儿童给予口服植物乳杆菌CCFM8724与安慰剂干预,探究植物乳杆菌CCFM8724对ECC关键菌属、口腔微生态及一些常见致病菌的影响。在益生菌有效性的前提下,通过基因组学进一步探究植物乳杆菌CCFM8724独特的基因组特征及功能,为今后靶向筛选抗ECC的益生菌进一步奠定遗传学基础。研究的主要结果如下:(1)通过采集同一名ECC儿童已发生龋损处与尚未发生龋损处的牙菌斑,并以健康儿童的牙菌斑为对照。确定了三组之间物种多样性与丰富度之间并无显著差异,而菌群结构存在一定差异,健康儿童的口腔菌群结构更稳定。每一名ECC儿童的不同健康状态牙菌斑的菌群结构存在显著差异。在菌属组成上,健康儿童口腔中的菌属包括奈瑟菌属(Neisseria)、纤毛菌属(Leptotrichia)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)和孪生球菌属(Gemella)。在ECC已形成龋损的部位处,主要菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏菌属(Veillonella)和普雷沃氏菌属7(Prevotella 7)。ECC儿童尚未发生龋患处的菌属主要包括放线菌属(Actinomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和贫氧菌属(Abiotrophia)等。菌属共存网络中,健康儿童口腔菌群互作关系最复杂。由10个菌属(Prevotella 7,Actinobacillus等)组成的随机森林模型具有临床诊断能力,对不同健康状态的分类准确率达89.8%。这从生态学角度确定了口腔菌群可用于ECC的早期预测和诊断,为饮食干预或益生菌靶向治疗提供一定的参考。(2)通过招募ECC儿童并实施为期8周的随机双盲、安慰剂对照的临床实验(导入期2周,干预期4周,洗脱期2周),摄入方式为口服。结果表明与安慰剂组相比,植物乳杆菌CCFM8724使ECC关键菌属(Veillonella)的相对丰度降低,而健康组关键菌属(Gemella)的相对丰度上升;10种关键菌属的共存网络复杂程度提升,更接近健康状态。在口腔微生态方面,植物乳杆菌CCFM8724改善了口腔菌群的组成和功能基因,表现为厚壁菌门(Firmicutes)、颗粒链菌属(Granulicatella)和孪生球菌属(Gemella)相对丰度增加,而变形菌门(Proteobacteria)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和卡氏菌属(Catonella)的相对丰度降低。在功能基因方面,植物乳杆菌CCFM8724提升了与金属离子,RNA转运等过程相关的酶的丰度。此外,植物乳杆菌CCFM8724可在14天内显著降低ECC儿童口腔内变异链球菌和白色念珠菌的平均含量(log DNA拷贝数/ng)。这些结果表明植物乳杆菌CCFM8724可在ECC儿童口腔健康方面发挥有益作用,扩大了植物乳杆菌CCFM8724的应用范围,为今后ECC的防治提供了新思路。(3)在确定植物乳杆菌CCFM8724具有改善ECC关键菌属及口腔微生态后,进一步通过比较基因组学初步探究植物乳杆菌CCFM8724的整体基因组和独特基因信息,以期找出植物乳杆菌发挥有益作用的功能基因。结果表明,作为无效对照的13株植物乳杆菌基因组长度为2.57-2.80 Mb,GC含量为45.1%-45.7%,CCFM8724的基因组长度为2.67 Mb,GC含量为45.5%。进化关系上,这些植物乳杆菌可分为5个分支,CCFM8724与VSCDJY5L5的亲缘关系较近,而与FGSYC25L4的亲缘关系较远。在直系同源基因中,CCFM8724的特异性基因为141条,这些基因功能主要涉及碳水化合物及氨基酸代谢等过程。GT111,AA1和AA4家族基因仅存在于CCFM8724中,提示CCFM8724具有独特的半乳糖、双酚类及芳香族类化合物合成,这些基因家族代谢的化合物可能具有抗ECC的作用。这些研究结果为今后进一步靶标筛选抗ECC的益生菌奠定了遗传学基础。
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