论文部分内容阅读
已知正链RNA病毒基因复制多定位在宿主内的特定膜结构上，由病毒RNA、病毒蛋白与宿主蛋白相互作用并对宿主膜结构进行改造，形成膜相关的病毒基因复制复合体。目前认为HCV的基因复制也采用类似的机制，在Golgi体及内质网膜上起始，由HCV RNA、病毒蛋白与宿主蛋白形成多成分复合体。已有文献报道HCV可通过其非结构蛋白与宿主蛋白hVAP33的相互作用，在类似脂筏的结构上组装病毒基因复制复合体。为进一步研究HCV基因复制复合体(Replication complexes，RC)的组成及其参与HCV复制调控的机理，本文首先应用HCV的亚基因组复制子模型(下简称复制子)，用不连续蔗糖梯度分离复制子细胞中的脂筏成分，Western blot及RT—PCR分析结果显示HCV的非结构蛋白NS3，NS5A和NS5B及基因组与脂筏的标志蛋白caveolin-2分布一致，提示其分布于脂筏成分。进一步用脂筏删除试剂mβCD处理复制子细胞后，发现HCV非结构蛋白及其正、负链RNA在脂筏上的定位明显减少，且HCV NS5A蛋白与已知HCV RC组分之一hVAP33蛋白的共定位消失，确认HCV RC存在于脂筏成分。将分离获得的脂筏成分蛋白用双向电泳分离，各蛋白点胰酶消化后用MALDI—TOF(matrix-assisted laser desorption／ionization-time of flight mass spectrometry)质谱进行鉴定。共鉴定出325个蛋白点，主要包括线粒体蛋白、信号分子、胞内运输蛋白、细胞骨架蛋白、参与翻译及RNA加工的蛋白等。其中包括已经报道的与HCV基因组发生相互作用的蛋白如actin，eIF3-subunit2，eIF3-P44，UNR protein，HnRNP K，HnRNPGHnRNPL，UNR-interacting proteins等；及与HCV蛋白发生相互作用的蛋白如Histone，14-3-3 protein，FYN，Apo E和cyclophilin B等。为确定脂筏蛋白中可能与HCV发生联系的蛋白，先利用生物信息学以已有的蛋白相互作用数据库为基础，结合最近发表的文献，对鉴定到的蛋白间的相互作用进行整理，得到相互作用图谱。结果显示蛋白相互作用图谱中与HCV发生联系的蛋白主要是细胞骨架蛋白，信号分子及HnRNP。此外，利用比较蛋白质组学，以复制子细胞的母细胞系Huh7作为对照，在复制子的脂筏蛋白中有60个蛋白发生上调，其中包括在蛋白相互作用图谱中与HCV发生联系的蛋白，如HSC71，T-complex protein和eIF3。再在复制子细胞中瞬时转染DsRed融合的脂筏蛋白，共聚焦分析是否与HCV NS5A共定位。结果显示ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog(UFD1L)，SNAP-γ，sytaxin17，PA28β，Ras-GTPase-activating protein binding protein 1(G3BP1)和nucleophosmin(NPM)可与NS5A发生共定位。鉴于SNAP-γ与sytaxin17和hVAP33同为SNARE家族成员，进一步用N-ethylmaleimide-sensitive factor(NSF)的永久失活体(NSF-DN)在复制子中抑制SNARE-介导的膜运输，发现NSF-DN能解离HCV RC，抑制HCV的复制。另外，在复制子中用针对G3BP1的siRNA干扰G3BP1的表达，显示可下调HCV的复制(p=0.027)，提示G3BP1可能为HCV RC的潜在成分进一步蛋白相互作用显示G3BP1与HCV NS5B相互作用；且定位于脂筏。本研究从分离鉴定含有HCV RC的脂筏成分入手，利用蛋白组学技术结合功能生物学分析，找到包括G3BP1等一些可能为参与HCV基因复制的细胞蛋白，为进一步研究HCV复制机制和研制抗HCV药物打下了良好的基础。