在分子水平上研究核酸-蛋白质的柏互作用及DNA序列的变化并开发简便、可靠、实用的临床样品检测方法是生命分析化学的重要研究内容。以DNA荧光探针为基础的实时荧光传感检测方法已成为解决其中关键问题的重要方法手段。但开已有的分子信标类探针用于检测核酸酶的活性时往律涉及多个寡聚核苷酸序列的设计,这些序列需要在检测之前进行杂交反应,反应体系复杂,计量比影响因素繁多,操作过程也不够简便。另外在癌症早期诊断相关的基因突变检测方法中,常规的实时荧光PCR法难以检测到丰度低于5％但临床意义重要的突变型,并且在检测多种未知类型的基因突变体时需要设计多种对应探针,大大增加了反应的复杂程度和检测成本。针对这些问题,本论文以开发准确、简单、成本低并适于临床应用的方法为目标,建立了基于单标记智能探针的核酸酶活性实时荧光传感分析体系和基于低温PCR-高分辨熔解曲线的基因突变高灵敏筛查体系。　　 论文主要包括以下内容:　　 设计构建单标记智能型DNA荧光探针检测体系。此类探针是茎环型自杂交结构,茎部其中一个末端由连续胞嘧啶组成并连接荧光基团,另一端设计百补配对的连续鸟嘌呤碱基利用其与荧光基团间的光诱导电子转移过程产生的荧光猝灭作用,设计反应使得鸟嘌呤的降解或产生米实现荧光信号的变化。这样,此类探针既是与核酸酶直接反应的底物又是产生信号变化的指示探针,降低检测成本的同时通过巧妙的设计可以灵敏准确地检测多种核酸酶功能。论文分别设计了水解与合成两种检测模式,成功应用于核酸外切酶和DNA聚合酶活性的实时监测。这是目前已报道的最简单快速的聚合酶活性检测方法,首次实现DNA3'-端单个碱基嵌入反应过程的实时监测,所获得的动力学数据证明本方法准确可靠。　　 单标记智能探针水解模式应用于多聚核苷酸激酶磷酸化活性检测。体系中以Lambda外切酶作为辅助工具酶,实现了多聚核苷酸激酶对DNA5'-末端磷酸化反应过程的实时监测。此方法用于检测T4多聚核苷酸激酶的线性范同为0.022～5.6nMs-1,底物分析浓度达到纳摩尔级。并且通过对标准磷酸酶样品的监测获得了其反应动力学参数,以此建立了快速、灵敏、准确的多聚核苷酸激酶活性分析方法。　　 单标记智能探针合成模式用于分析测定聚合酶保真性。通过巧妙设计单标记探针3'-末端碱基对及其紧邻碱基对、控制反应溶液中的dNTP组成,实现了聚合酶保真性的分步测定。研究内容包括碱基错配形成,错配延伸,校读修复过程,并且可以比较不同聚合酶的校读活性强弱。这是目前已报道的唯一可连续实时检测天然碱基间错配反应过程的荧光探针方法。　　 建立了低温PCR-高分辨熔解曲线(HRM)检测体系,对基因突变体实现了选择性富集扩增和分型筛查。本方法通过优化PCR的退火温度(低温PCR),使得KRAS基因突变型模板比野生型模板易于解链从而被选择性扩增,通过多轮低温PCR扩增,突变型模板的最人富集倍数可达80倍。在此改良的低温PCR中,用饱和型嵌入染料探针通过HRM检测KRAS突变体的灵敏度至少可提高一个数量级,并且成功地用于癌症组织样品中KRAS基因突变体的诊断。此方法结合低温PCR选择性富集突变型和HRM简单灵敏区分基因类型的优势,可以对特定靶序列未知基因类型的低丰度突变体进行提取式富集并快速筛选检测,尤其适用于已知癌症相关和热点突变区的基因诊断。　　 本论文研究工作将发展分析化学新方法和新体系,同解决生命科学问题及临床检测需求紧密结合。利用碱基与荧光基团之间的光诱导电了转移过程产生的猝灭现象构建了新型单标记智能探针核酸酶活性检测体系,并应用于核酸外切酶、多聚核苷酸激酶和DNA聚合酶活性的实时监测研究;另外建立了基于低温PCR-高分辨熔解曲线分析的低丰度突变体富集筛金方法,为临床基因诊断与治疗提供了便捷又准确的分析途径。本论义建立的基于实时荧光传感原理的检测方法,为生命科学关注的热点领域发展出了新的研究思路和有力的分析手段。