研究背景　　根据调查研究发现白血病仍然是我国儿童发病率最高的恶性肿瘤，故对白血病的治疗尤其重要。目前虽然针对白血病的研究越来越多，治疗方案也不断优化，儿童白血病通过化疗其五年生存率也有所提高，但是在治疗过程中仍会发生耐药现象及治疗相关性死亡，这成为当今白血病治疗的难题并阻碍了治疗的进展。近年来，很多研究发现化疗耐药与肿瘤微环境相关，故白血病的治疗不但要对白血病细胞有杀伤作用，同时对其生存的微环境也要有抑制作用。　　化疗的最终作用是杀灭肿瘤细胞，而发生耐药现象是指对肿瘤细胞的杀伤不完全或失败。阿糖胞苷是治疗白血病的一线药物，应用广泛，故阿糖胞苷发生耐药将会阻碍治疗进展。阿糖胞苷发生耐药的机制多种多样，其中肿瘤微环境是其中的重要原因之一，而间充质干细胞是微环境的重要组成部分。在体外和体内研究中，骨髓间充质干细胞可以通过直接粘附作用、分泌多种细胞因子（如趋化因子CXCL12、白介素-6（IL-6）、血管生成因子（VEGF）等）和免疫抑制等多种途径来调节肿瘤细胞的BCL-2、Caspase等凋亡相关基因或蛋白的表达，从而参与细胞的生长、分化、迁移和耐药等。　　近十几年来，开发逆转耐药的新型药物成为热点，但能在临床研究使用的药物仅有少数，因此，寻找有效、低毒和价廉的化疗耐药逆转剂成了亟待解决的问题。而在某些实体瘤和血液恶性肿瘤（如急性髓细胞白血病等)研究中发现钙通道阻滞剂(维拉帕米、硝苯地平）能增强化疗药物杀伤肿瘤细胞的作用。与其他钙通道阻滞剂相比，尼莫地平（nimodipine,NMDP）可以通过血脑屏障，对脑动脉的作用远强于全身其他部位动脉的作用，对髓外白血病尤其是中枢神经系统白血病的防治有独到之处，并对心脏的毒副作用较小。同时，有研究表明尼莫地平还能影响MSC的增殖和分化，但尼莫地平能否逆转骨髓间充质干细胞引起的白血病细胞耐药尚无明确报道。因此，本实验以急性淋巴细胞白血病细胞株和急性髓性白血病细胞株为研究对象，体外模拟骨髓微环境系统，建立与骨髓间充质干细胞共培养系统，通过检测白血病细胞的凋亡率和抗凋亡基因BCL-2和凋亡基因Caspase3的表达，来研究骨髓间充质干细胞对阿糖胞苷诱导白血病细胞凋亡的影响，并探讨尼莫地平在其中的作用。　　目的：　　1、探讨骨髓间充质干细胞对Jurkat、HL-60细胞株在阿糖胞苷作用下的保护作用及其凋亡机制的影响。　　2、探讨尼莫地平对阿糖胞苷诱导Jurkat、HL-60细胞株凋亡的影响及其机制。　　3、探讨尼莫地平对骨髓间充质干细胞影响阿糖胞苷诱导Jurkat、HL-60细胞株凋亡中的作用及其初步机制。　　方法:　　1、体外分离、培养、鉴定骨髓间充质干细胞。　　2、用MTT法检测Jurkat、HL-60细胞株阿糖胞苷的IC50和尼莫地平的工作浓度。　　3、构建MSC与Jurkat、HL-60细胞株的共培养系统。　　4、实验分组：　　1）非共培养组：①Jurkat、HL-60细胞株单独培养组；②Jurkat、HL-60细胞株+阿糖胞苷组（阿糖胞苷处理组）；③Jurkat、HL-60细胞株+阿糖胞苷+尼莫地平组（阿糖胞苷和尼莫地平联用组）。　　2）共培养组：①Jurkat、HL-60细胞株与骨髓间充质干细胞共培养组（共培养组1）；②Jurkat、HL-60细胞株与骨髓间充质干细胞共培养+阿糖胞苷组（共培养组2）；③Jurkat、HL-60细胞株与骨髓间充质干细胞共培养+阿糖胞苷+尼莫地平组（共培养组3）；④尼莫地平预处理骨髓间充质干细胞后与Jurkat、HL-60细胞株共培养+阿糖胞苷组（共培养组4）。　　5、用流式细胞仪检测不同实验组的凋亡率。　　6、RT-qPCR法检测不同实验组的BCL-2和Caspase3基因的表达。　　技术路线：此处公式省略　　实验结果：　　1.骨髓间充质干细胞表现为形态均一的梭形有核细胞，阳性表达 CD44、CD105分子，阴性表达CD45、CD34分子。　　2.阿糖胞苷对 Jurkat、HL-60细胞株的工作浓度分别为0.001mg/ml、0.01mg/ml，单独使用尼莫地平对Jurkat和HL-60细胞株无增殖抑制作用，与阿糖胞苷（工作浓度下）联用时可使Jurkat和HL-60细胞株的增殖抑制增加并在浓度为0.04mg/ml时抑制率最高。　　3.阿糖胞苷对 Jurkat、HL-60细胞株的影响：Jurkat、HL-60细胞株经阿糖胞苷处理后，其凋亡率升高（P<0.05),并可以下调BCL-2mRNA表达（P<0.05），上调Caspase3mRNA表达（P<0.05）；　　4.骨髓间充质干细胞对Jurkat、HL-60细胞株的影响：共培养组1与单独培养组相比，Jurkat和HL-60细胞株凋亡率下降（P<0.05),上调BCL-2mRNA表达（P<0.05），下调Caspase3mRNA表达（P<0.05）；共培养组2与阿糖胞苷处理组相比，Jurkat和HL-60细胞株凋亡率下降（P<0.05),BCL-2mRNA表达水平升高（P<0.05），Caspase3mRNA表达水平下降（P<0.05)。　　5.尼莫地平对阿糖胞苷诱导Jurkat、HL-60细胞株凋亡的影响：阿糖胞苷与尼莫地平联用组与阿糖胞苷处理组相比，Jurkat和HL-60细胞株凋亡率升高（P<0.05),BCL-2mRNA表达水平下降（P<0.05），HL-60细胞株的Caspase3mRNA表达水平升高（P<0.05），而 Jurkat细胞株的 Caspase3mRNA表达水平无明显变化。　　6.尼莫地平对骨髓间充质干细胞降低阿糖胞苷对Jurkat、HL-60细胞株诱导凋亡的影响：与共培养组2相比，共培养组3与共培养组4的 Jurkat、HL-60细胞株的凋亡率升高（P<0.05)；HL-60细胞株中BCL-2mRNA表达水平下降（P<0.05），Caspase3mRNA表达水平无明显变化；而 Jurkat细胞株中只有共培养组4的BCL-2mRNA表达水平下降（P<0.05)，Caspase3mRNA表达和共培养组3的BCL-2mRNA表达水平无明显变化。两种细胞株中共培养组3与共培养组4相比其凋亡率、BCL-2mRNA和Caspase3mRNA表达水平皆无明显变化。　　结论：　　1.骨髓间充质干细胞能降低Jurkat、HL-60细胞株自发性的和阿糖胞苷诱导下的凋亡率，可上调BCL-2mRNA的表达和下调Caspase3mRNA的表达，说明骨髓间充质干细胞可能通过上调抗凋亡基因 BCL-2和下调凋亡激活因子Caspase3mRNA的表达来保护Jurkat、HL-60细胞株，并减弱阿糖胞苷对白血病细胞诱导凋亡的作用。　　2.尼莫地平加强阿糖胞苷诱导Jurkat、HL-60细胞株凋亡的作用，其凋亡机制可能与BCL-2mRNA表达下降有关，对于HL-60细胞株其诱导凋亡机制还可能与上调Caspase3mRNA表达有关。　　3.在骨髓间充质干细胞与白血病细胞共培养组中，尼莫地平可增强共培养组中阿糖胞苷对Jurkat、HL-60细胞株凋亡诱导能力，并能下调共培养组HL-60细胞株和尼莫地平预处理骨髓间充质干细胞组Jurkat细胞株的BCL-2mRNA表达；其凋亡情况、BCL-2mRNA和Caspase3mRNA表达情况与尼莫地平预处理骨髓间充质干细胞后加阿糖胞苷还是在共培养中同时与阿糖胞苷联用无关。说明尼莫地平不仅能与阿糖胞苷协同杀伤白血病细胞，同时也能部分逆转 MSC介导的阿糖胞苷耐药。