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近年来随着安徽省河蟹养殖规模的不断扩大，细菌性疾病时有暴发与流行，其中由拟态弧菌（Vibrio mimicus）引起的弧菌病是影响养蟹业最为常见、危害性较重的一种疾病，严重制约了养蟹业的发展。因此，加深对拟态弧菌生物学特性及其致病机理等方面的研究，对于寻找切实有效的疾病防治措施，振兴水产养殖业具有深远的意义。本实验室从发病河蟹体内分离鉴定到一株拟态弧菌（HX-4菌株），并对其致病性进行了初步研究，确定为致病菌。本课题应用细菌学和分子生物学方法对该菌株外毒素的致病性、最佳产生条件、提取方法和生物学特性进行了系统研究。旨在为进一步研究该菌的致病机理和研制毒素疫苗奠定一定的理论基础。 首先，应用动物试验测定拟态弧菌HX-4菌株外毒素的致病性、毒力和肠毒性。分别使用外毒素提取液和活菌体（3×108 CFU／mL）接种实验小鼠和河蟹，结果显示外毒素与菌体对实验动物均有致病性，致死率均为100％，但致死时间明显不同，前者为2h～10h，而后者为24h～36h。毒力试验结果显示外毒素对河蟹的半数致死量(LD50)为1.40μg。兔皮肤蓝斑试验结果显示外毒素具有不耐热性肠毒素活性。这些均表明该菌产生的外毒素在其致病过程中发挥主要作用。 其次，对拟态弧菌HX-4菌株的最佳产毒条件进行了优化。结果显示培养基的种类、氯化钠浓度和初始pH，培养温度、培养时间与培养方式等环境参数对细菌的产毒量均有明显影响，其最佳产毒条件是：采用初始pH 8.0，含0.5％ NaCl的脑心浸液（BHI）培养基，28℃振荡培养36 h或静置需氧培养48 h。 再次，采用固体硫酸铵盐析法和层析技术建立了拟态弧菌HX-4菌株外毒素的提取方法。研究中对硫酸铵饱和度与离子交换层析洗脱缓冲液pH进行了优化，结果显示当硫酸铵饱和度为50％时，外毒素总蛋白得率较高，其溶血素和蛋白酶活性最强；DEAE-Sephadex A50离子交换层析以使用洗脱缓冲液为pH 7.8，0.05 mol／L的Tris-HCl缓冲液经0～0.6 mol／L NaCl线性梯度洗脱后所得的外毒素蛋白得率最高，酶活性也最强。根据上述优化的最佳条件，细菌培养上清液依次进行50％饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析（平衡和洗脱液为0.3 mol／L NaCl的pH7.8，0.05 mol／L Tris-HCl缓冲液），每100毫升培养液可提取0.2mg外毒素。 进一步应用SDS-PAGE电泳和指示凝胶技术测定了外毒素的分子量和活性酶成份，并对指示凝胶技术的条件进行了优化。结果显示，外毒素的最佳电泳上样量为3μL，电泳后用2.5％ Tritox-100去除SDS，分别以含0.5％酪蛋白的 0．8％琼脂糖平板、含 0．4％明胶的 0．8％琼脂糖平板和含 1％兔红细胞的 0．8％琼脂糖平板作指示，移位消化 1．0 h，再用考马斯亮蓝 R－250染色，在蓝色（酪蛋白酶和明胶酶）或暗红色（溶血素）背景下均可见到较清晰的3条无色透明带，表明外毒素含有 3种活性蛋白成份，它们分子量分别为 154KD、143 KD和 117 KD，均具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶和溶血素活性。 最后，采用酶活性试验和细胞毒试验等对外毒素的酶活性、稳定性和细胞毒性等生物学特性进行系统测定。琼脂平板扩散法和试管法测定外毒素酶活性的结果显示该菌外毒素具有较强的酪蛋白酶、明胶蛋白酶、溶血素和卵磷脂酶活性，几丁质酶活性次之，不具有血浆凝固酶、脂酶和 DNase酶活性。微量板法测定外毒素溶血谱及溶血价的结果显示外毒素能溶解鼠、兔和鲫等8种动物及人的红细胞，溶血价在 1：2—l：1024之间，但对鹅和猪的红细胞无溶血作用，表明外毒素对红细胞的溶血作用具有选择性。稳定性试验结果逢示该菌外毒素经 100℃处理 lmin酶活性丧失；于－20oC、4oC和 25C保存 1个月，除几丁质酶活性丧失外，其它酶活性略有降低：胰酶、乙二胺四乙酸及二硫苏糖醇抑制剂对外毒素酶活性作用不明显；除Znk和Fe卜两种离子外，CaZ＼BaZ”和＊”二价金属阳离子对酶活性影响不明显，表明除热外，其它环境因素改变对其活性影响不大。细胞微量板法检测外毒素细胞毒性结果显示接毒后 lh即产生细胞病变，24h后病变细胞聚集成葡萄状，大部分细胞脱落，其半数组织细胞感染量(TCIDS＊为 0．025 pg，表明外毒素对 HEp上细胞具有较强的细胞毒性， 综上所述，拟态弧菌HX－4菌株外毒素含有3种蛋白成份，相对分子量分别为 154 KD、143 KD和 117 KD。外毒素具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、溶血素、卵磷脂酶和几丁质酶等多种毒性酶活性、细胞毒性、不耐热肠毒性、致死性及相对稳定性。