骨缺损、特别是大段骨缺损常因战创伤高能量损伤性骨折、严重开放性骨折伴感染、骨不连多次手术植骨内固定失败、骨髓炎病理性骨折及大块死骨切除、先天性胫骨假关节及肿瘤大段骨切除等所致。传统的手术治疗方法极为困难,最终很多病例不得不采用截肢术或用支具保护性负重。因此其治疗成为骨科临床的一大难点,探索新的治疗手段成为当前国内外骨科界的迫切需求。近年来,骨组织工程技术成为骨缺损修复的研究重点。其研究多集中在种子细胞的选择与培养及支架材料的选择与修饰两方面。国内外许多学者和我们的早期研究证明,用组织工程骨修复小段骨缺损时,其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时,其核心部位往往发生缺血坏死,导致修复失败,其主要原因就在于未能很好解决组织工程骨的血管化问题。目前的主要方法有:(1)血管内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)与成骨细胞(Osteoblast)或血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)加生物材料联合移植。但ECs体外培养的要求很高,周期长,规模扩增相当困难,且成熟ECs的成血管作用较弱。(2)利用血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血管生成素(Angiopoietin,Ang)等与生物材料复合促进血管生长。但直接应用的促血管生长因子在体内迅速降解,达不到理想的效应浓度。因此有学者将各种促血管生长因子的基因转染种子细胞,再将其种植于支架材料表面构建组织工程骨后植入骨缺损部位,这是组织工程骨血管化的主要研究方向之一。但存在如何提高转染率,使细胞高效表达及生物安全性问题。(3)应用显微外科技术将成骨细胞、生物材料及带血管蒂的组织瓣包埋或血管束植入重建组织工程骨血运。此方法造成异位创伤,且治疗周期长。因此,对于皮肤、心脏瓣膜等较薄的组织工程移植体,其血运的重建能较容易地在早期完成,而对于体积较大、功能复杂的骨组织,其早期血管化问题就成为了目前限制组织工程骨修复大段骨缺损应用的关键所在。血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)最早由Asahara等于1997年报道,它是一群具有游走特性,尚未表达成熟血管内皮细胞表型,体外培养后能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。它不仅参与人胚胎血管生成,而且在骨髓、脐带血及外周血中均存在能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用,并以血管发生方式形成新生血管的EPCs。这一发现,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论,为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。近年来,有关EPCs在成体血管形成中作用的研究主要集中在缺血心肌、缺血肢体、损伤角膜、损伤皮肤的修复等方面。随着日益成熟的分离培养、诱导和扩增技术,EPCs可以相对容易地从外周血或骨髓中获得。因此,本实验拟从动物自体骨髓中分离出单个核细胞,经体外培养、诱导后获得EPCs,并将其与同样来源于自体骨髓的经成骨诱导的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)及脱钙骨基质(Decalcified Bone Matrix,DBM)共同构建促血管化组织工程骨。建立兔桡骨20%大段骨缺损修复模型,观察组织工程骨的早期血管化程度及骨缺损区新生骨愈合效果。主要实验方法及结果:1.采用密度梯度离心法从兔自体骨髓中得到单个核细胞,在特定的条件下进行分离纯化,通过贴壁培养、体外扩增获取细胞,采用细胞表型检测、免疫组化及免疫双荧光等方法进行鉴定,结果证实通过此方法获得的细胞即是EPCs。2.采用密度梯度离心法将来源于自体骨髓的单个核细胞进行分离纯化、体外传代培养,获得纯度较高、能满足组织工程种子细胞数量要求的BMSCs。通过骨钙素免疫组化、钙结节茜素红染色及四环素荧光染色等方法进行鉴定,证实其在成骨诱导条件下,能向成骨细胞方向分化。将经成骨诱导的BMSCs与EPCs按1:1的比例置于DBM支架上,在体外条件下构建促血管化组织工程骨。3.建立兔桡骨20%大段缺损模型,将体外构建的EPCs促血管化组织工程骨植入骨缺损区。通过墨汁灌注、免疫组化、放射性核素骨显像等方法观察组织工程骨的早期血管化情况,结果显示手术后2周骨缺损区血流量开始升高,4周和8周时达到峰值,12周后开始下降。EPCs组的局部血流量在术后2、4、8周明显高于对照组,提示EPCs能促进组织工程骨的早期血管化。4.观察EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损时骨愈合情况。X线片结果显示,EPCs组术后4周骨痂明显多于对照组,8周可见髓腔部分再通,对照组髓腔尚封闭,12周新生骨密度均匀,髓腔已完全再通,而对照组新生骨仍可见部分低密度区,髓腔大部分再通。16周实验组新生骨已基本完成塑形,对照组髓腔完全再通,新生骨处于重建塑形期。骨密度、组织学光镜、透射电镜、免疫组化等结果显示EPCs组的成骨活跃程度、骨愈合速度均优于对照组。12、16周生物力学测试结果显示EPCs组骨抗扭强度高于对照组。提示EPCs促血管化组织工程骨成骨能力强,能促进骨愈合,是修复大段骨缺损的有效方法。结论1.采用密度梯度离心法收集兔自体骨髓中的单个核细胞,在特定的诱导条件下通过贴壁培养可以获取足够数量的EPCs,在短时间内可在体外扩增,并最终分化为有功能的具有内皮细胞特异性标志物的成熟血管内皮细胞。同时由于EPCs来源于自体骨髓,不存在移植后免疫排斥问题,为临床应用提供了可能。2.采用密度梯度离心法从骨髓中获得的单个核细胞在一定条件下可以在体外大量扩增,获得足量和纯度较高的BMSCs。在成骨诱导条件下,可以向成骨细胞方向分化。因此,BMSCs是骨组织工程理想的种子细胞。DBM因其良好的组织相容性和无细胞毒性而成为骨组织工程较为理想的支架材料之一。将EPCs与经成骨诱导的BMSCs共同置于DBM支架上,可在体外条件下成功构建促血管化组织工程骨。3.来源于自体骨髓的EPCs及经成骨诱导的BMSCs两种细胞与DBM共同构建的促血管化组织工程骨修复兔桡骨20%大段骨缺损,能促进组织工程骨的早期血管化,并进一步促进成骨,加速骨愈合。为临床采用EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的设想提供了实验基础。