目的:胃癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，在肿瘤中致死率居第二位。我国是胃癌高发国家，每年新发病例占全球的40％，外科手术彻底切除癌灶是胃癌治疗首选方法。我国多数胃癌患者在诊断时已属进展期并出现远处转移，预后较差，5年生存率仅20％左右。因此，药物治疗在胃癌的治疗和抑制转移方面占据重要地位。迄今为止，从植物中提取得到的活性成分抗癌效果理想，作用机制独特，已经应用于临床，且逐渐占据主导地位。因此，低毒性、高选择性的天然产物抗癌药物的开发和研制就成为研究热点。　　土槿皮，又叫土荆皮、金钱松皮，是松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮。中医形容其性温、味辛、有毒，归肺、脾经。土槿皮是常用中药，具有杀虫、止痒的疗效，在临床上应用于治疗真菌感染。目前，已从土槿皮中分离到20余种土槿酸，其中土槿乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是主要成分之一。PAB是二萜酸化合物，分子式为C23H2808。近期研究发现，PAB还具有抗肿瘤、抗生育、抗血管生成、抗真菌等作用，根据PAB结构合成的衍生物也具有较强的抗肿瘤作用。　　本课题主要研究土槿乙酸体外诱导人胃癌细胞BGC-823、MKN-45凋亡及抑制转移的机制;土槿乙酸体内抑制裸鼠胃癌BGC-823细胞移植瘤生长及抑制血行播散转移的机制。　　研究方法:1.土槿乙酸体外诱导人胃癌BGC-823、MKN-45细胞凋亡及作用机制　　常规培养人胃癌BGC-823、MKN-45细胞，采用MTT方法检测不同作用浓度和不同作用时间土槿乙酸对人胃癌BGC-823、MKN-45细胞增殖的影响及IC50值;流式细胞术检测不同作用浓度和不同作用时间土槿乙酸对细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位的影响;Elisa实验检测土槿乙酸处理后人胃癌BGC-823、MKN-45细胞中活性的Caspase-3表达情况;Real-time RT-PCR方法检测土槿乙酸作用人胃癌BGC-823、MKN-45细胞后Bcl-2、Bax、PPARγmRNA表达的变化;Western-Blot方法检测不同浓度土槿乙酸作用不同时间后对人胃癌BGC-823、MKN-45细胞中信号通路关键蛋白AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2和Bax蛋白及抑癌蛋白p53表达的影响。所获得的数据均使用SPSS19.0软件分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的方法进行比较。显著性水平F=0.05。　　2.土槿乙酸体外抑制人胃癌BGC-823、MKN-45细胞转移及作用机制　　常规培养人胃癌BGC-823、MKN-45细胞，采用MTT方法检测10μmol/L土槿乙酸处理24h后，对人胃癌BGC-823、MKN-45细胞与基质胶Matrigel粘附能力的影响;采用划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验检测土槿乙酸对人胃癌BGC-823、MKN-45细胞迁移和侵袭能力的影响;采用克隆形成实验检测土槿乙酸对人胃癌BGC-823、MKN-45细胞克隆形成能力的影响;Western-blot方法检测土槿乙酸对人胃癌BGC-823、MKN-45细胞中转移相关蛋白E-Cad、MMP-9、HIF1α、VEGF、VEGFR2和Ezrin表达情况。所获得的数据均使用SPSS19.0软件分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的方法进行比较。显著性水平F=0.05。　　3.土槿乙酸对裸鼠体内人胃癌BGC-823异种移植瘤生长及血行播散转移灶形成的影响及作用机制　　购得上海斯莱克实验动物有限公司BALB/c-Nude裸鼠10只，周龄4-6周，雄性，体重18-20g左右。将裸鼠随机平均分成两组，分别注射人胃癌BGC-823、（5×106个细胞）于无菌条件下接种于裸鼠右腋窝下。隔天测量裸鼠体重，游标卡尺测量瘤体长短径，计算移植瘤体积。当体积达到100mm3时随机分为两组，一组（对照组）采取腹腔注射生理盐水0.2ml，另一组（PAB治疗组）腹腔注射药物土槿乙酸(30mg/kg)0.2ml。连续注射15天后处死裸鼠，手术取出胃癌瘤体，称取瘤重，计算抑瘤率;Real-time RT-PCR方法检测胃癌BGC-823裸鼠异种移植瘤组织中Bcl-2、Bax、PPARγ mRNA的表达情况;免疫组化方法检测对照组与土槿乙酸治疗组移植瘤组织中微血管密度、VEGF、Ki67蛋白表达情况。　　购得上海斯莱克实验动物有限公司BALB/c-Nude裸鼠10只，周龄4-6周，雄性，体重22g左右。尾静脉注射0.15ml人胃癌BGC-823细胞（5×106个细胞）。注射后三天随机将裸鼠分成两组，一组（对照组）采取腹腔注射生理盐水0.2ml，另一组（PAB治疗组）腹腔注射药物土槿乙酸(30mg/kg)0.2ml，连续注射15天。注射细胞8周后处死裸鼠，分别取小鼠肺脏和肝脏，制作蜡块后，HE染色，观察转移灶及PAB对脏器的影响。　　结果:1.土槿乙酸体外抑制人胃癌BGC-823、MKN-45细胞增殖，诱导细胞凋亡　　(1)、不同浓度、不同作用时间PAB处理BGC-823、MKN-45细胞后，PAB能够显著抑制胃癌细胞增殖，且这种抑制作用呈现时间和剂量依赖性。PAB对BGC-823的IC50值为16.407μmol/L，而5-Fu对BGC-823的IC50值为634.053μmol/L。PAB对MKN-45的IC50值为17.062μmol/L，而5-Fu对MKN-45的IC50值为1217.062μmol/L。　　(2)不同浓度、不同作用时间PAB均可在体外诱导BGC-823、MKN-45细胞凋亡，使细胞周期阻滞在G2/M期。　　(3)10μmol/L PAB处理细胞后，可显著降低人胃癌BGC-823、MKN-45细胞线粒体膜电位并激活Caspase-3。　　(4)PAB作用BGC-823、MKN-45细胞后，Bax/Bcl-2 mRNA比值升高，PPARγmRNA表达上调。　　(5) PAB作用BGC-823、MKN-45细胞后，能够显著降低p-ERK1/2与总ERK1/2比值及p-Akt与总Akt比值，下调Bcl-2蛋白表达，上调抑癌蛋白p53和Bax蛋白表达。　　2.土槿乙酸体外抑制人胃癌BGC-823、MKN-45细胞转移　　(1)10μmol/L PAB处理BGC-823、MKN-45细胞后，胃癌细胞与基质胶Matrigel的粘附能力被显著抑制，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　(2)划痕实验结果显示，在24h、48h和72h三个时间点，与对照组相比较，不同浓度PAB作用人胃癌BGC-823、MKN-45细胞后，显著抑制BGC-823、MKN-45细胞迁移，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　(3) Transwell小室侵袭实验结果显示，在24h、48h和72h三个时间点，不同浓度PAB作用人胃癌BGC-823、MKN-45细胞后，穿膜细胞数较对照组显著减少。PAB可以显著降低人胃癌细胞BGC-823、MKN-45的侵袭能力。　　(4)平板克隆形成实验结果显示，与对照组相比较，0.5、2μmol/LPAB处理人胃癌BGC-823、MKN-45细胞后，克隆形成数显著降低，统计学差异非常显著(P＜0.01)。　　(5) Western-blot实验结果显示，PAB作用人胃癌BGC-823、MKN-45细胞后HIF1α、VEGF、VEGFR2和MMP-9蛋白表达下调，E-Cad和Ezrin蛋白表达上调。　　3.土槿乙酸抑制胃癌异种移植瘤生长，抑制血行播散胃癌肺转移　　(1)裸鼠皮下异种移植瘤实验结果显示，土槿乙酸治疗组(30mg/kg)治疗后较对照组，皮下瘤瘤重明显小于对照组皮下瘤瘤重，抑瘤率达到51.66％，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　(2) Real-time RT-PCR结果显示，相比较对照组移植瘤组织，土槿乙酸治疗组移植瘤组织中Bax/Bcl-2 mRNA比值升高，PPARγ mRNA显著上调，与体外实验结果一致。　　(3)移植瘤免疫组化结果显示，与对照组比较，土槿乙酸治疗组微血管密度和VEGF蛋白表达均轻度下调，Ki67蛋白表达显著下调。　　(4)胃癌细胞体内血行播散模型裸鼠实验结果显示，5例对照组均发生肺转移，肺转移瘤很大，未发现肝转移，无肝损伤;土槿乙酸治疗组(30mg/kg)5例均发生肺转移，转移瘤与对照组相比明显减小，未发生肝转移。　　结论:(1)土槿乙酸体外可诱导人胃癌BGC-823、MKN-45细胞凋亡，使细胞周期阻滞在G2/M期，其机制可能与下调PI3K/AKT通路和ERK1/2通路有关;PAB同时通过线粒体通路诱导两种细胞凋亡。　　(2)土槿乙酸体外抑制人胃癌BGC-823、MKN-45细胞侵袭、迁移、克隆形成及与基质胶的粘附能力，下调HIF1α、VEGF、VEGFR2和MMP-9蛋白表达，使E-Cad、Ezrin蛋白表达上调。　　(3)土槿乙酸体内抑制裸鼠胃癌移植瘤生长及血行播散肺转移灶的形成，机制可能与Bax/Bcl-2 mRNA比值升高，PPARγ mRNA表达上调及Ki67蛋白表达下调有关。