本研究分为二部分： 第一部分、乙型脑炎减毒株SA14—14—2全长感染性克隆及恢复病毒的获得 运用long RT—PCR技术，应用融合PCR方法扩增出乙型脑炎病毒（JEV）全长基因组。根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物，分别扩增JEV SA14—14—2株的5’和3’半长分子，在5’端上游引物中引入T7启动子核心序列。利用细胞培养增殖病毒，提取病毒RNA，逆转录后采用long PCR方法得到JEV的两个约6 kb的5’和3’半长分子，在此基础上进行融合PCR得到约11kbJEV全长cDNA分子，并克隆入pGEM T—easy载体，并经基因序列分析以及E蛋白氨基酸序列比对，验证所得全长cDNA分子的基因片段。然后将全长转入改造后的pBluescript载体上。经T7启动子体外转录以及lipofectin介导的转染，将转录产物RNA转染BHK—21细胞。为鉴定恢复病毒是否具有感染性，通过细胞病变、噬斑试验，间接免疫荧光试验，以及E蛋白区特异基因序列扩增，将恢复病毒与亲代病毒进行比较，从而证实恢复病毒具有感染性。 第二部分、流行性乙型脑炎活疫苗株（SA14—14—2）和黄热活疫苗株（17D）的神经毒力减弱的分子基础 一、乙型脑炎病毒活疫苗株（SA14—14—2）神经毒力减弱的分子基础； 本研究将乙型脑炎病毒疫苗用减毒株SA14—14—2经过乳鼠鼠脑连续传代3次，通过对其第一代，第三代得到的毒株SA14—14—2M1和SA14—14—2M3进行全序列测定，并与疫苗用减毒株SA14—14—2、野毒株SA14进行核苷酸和氨基酸序列分析，从而在分子水平上阐明减毒机理，对毒力相关基因进行定位具有重要意义。运用RT—PCR方法，分段扩增出覆盖基因组全长的基因片段，PCR产物纯化后直接测序，针对5’和3’端的片段TA克隆后进行测序。经核苷酸序列测定后，利用DNAStar软件，进行序列比对分析，并与疫苗用减毒株SA14—14—2、野毒株SA14进行序列比对。分析结果表明经乳鼠鼠脑回传后，第三代SA14—14—2M3较之第一代SA14—14—2M1其病毒滴度明显增高，脑内致病力也明显增强，但毒力并未完全返祖。通过序列比对分析发现，第三代SA14—14—2M3株在E区毒力相关位点E107、E138位点发生回复突变，是其毒力增强的主要原因。其次，在非结构蛋白NS5区，也发现SA14—14—2M1和SA14—14—2M3发生回复突变的若干位点，这些位点的回复突变对病毒毒力的增强起到了辅助作用。此外，通过对SA14—14—2M1和SA14—14—2M3毒株与疫苗用减毒株SA14—14—2和野毒株SA14的3UTR区域RNA二级结构分析，发现SA14—14—2M1和SA14—14—2M3毒株的3UTR区域RNA二级结构明显与野毒株SA14的结构相似，不同于减毒株SA14—14—2。这也可能是乳鼠鼠脑回传后病毒毒力增强的一个原因。 通过对乙型脑炎病毒疫苗用减毒株SA14—14—2经乳鼠鼠脑连续传代3次获得的毒株SA14—14—2M1和SA14—14—M3进行核苷酸及氨基酸序列分析，针对其主要病原基因与野毒株SA14及疫苗用减毒株SA14—14—2相互进行比对分析，发现E蛋白区E107、E138是与毒力密切相关的重要位点，而非结构蛋白区域的回复突变起到了毒力增强的辅助作用。 二、黄热活疫苗株（17D）的神经毒力减弱的分子基础； 通过对中国黄热疫苗生产用减毒株与WHO黄热疫苗参考株基因组核苷酸序列全测定，从而寻找二者之间基因序列的相似性，了解其核苷酸序列变异程度和与其相关的氨基酸是否发生突变。本研究根据GenBank中收录的黄热病毒YF17D序列设计引物，提取该二株黄热病毒的RNA，逆转录后PCR扩增病毒各部分基因片段，PCR产物纯化后直接测序，5’和3’端TA克隆后进行测序，然后进行遗传进化分析。经核苷酸序列测定后利用DNAStar软件进行序列比对分析，并与GenBank中收录的相关YF17D疫苗株和野毒株进行序列比对。分析结果表明该两株黄热病毒减毒株间的核苷酸序列并未发生较大变异，核苷酸和氨基酸的同源性分别约为99%和99%。通过与其它YF17D疫苗株序列比较后发现也具有很高的同源性。其重要病毒抗原E蛋白也未发生较大突变，但发现中国黄热疫苗生产用减毒株E区与毒力相关的第173位氨基酸发生回复突变。进一步通过系统发生分析说明二者间亲缘关系十分接近。以上结果说明在传代过程中累积的突变率极低，基因组相对比较稳定。但发现个别氨基酸发生回复突变，应引起重视。在传代过程中中国黄热疫苗株和WHO黄热疫苗参考株在基因水平上并未发生较大改变，其基因组具有一定的稳定性。