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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge),唇形科鼠尾草属多年生草本药用植物,其干燥根及根茎对心脑血管类疾病有明显的预防和治疗功效。丹参酮类和酚酸类物质是丹参的主要药用成分。近年来,对于丹参次生代谢调控机制的研究多集中在转录因子调控丹参酮类和酚酸类物质的功能验证方面。前期研究表明,转录因子SmbHLH128和SmMYB36对丹参药用成分的次生代谢有显著的调控作用。蛋白质的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)可调节生物的生长发育和胁迫应答等机制,泛素化是最普遍的PTMs之一。丹参中转录因子的泛素化修饰研究目前未见报道。因此,本研究以丹参转录因子SmMYB36和SmbHLH128为研究对象,利用烟草瞬时表达体系、转基因拟南芥体系及Cell free体外实验体系对其降解过程进行多体系探究,并在此基础上克隆了一个丹参E3泛素连接酶Sm COP1a,为明确SmMYB36和SmbHLH128泛素化降解特点,进一步探究其介导的泛素化机制提供了理论依据。主要研究结果如下:1、通过烟草瞬时表达体系对SmMYB36和SmbHLH128进行表达。DMSO对照组,His-SmMYB36融合蛋白和His-SmbHLH128蛋白均有少量积累,SmbHLH128蛋白在MG132处理下蛋白含量有明显升高,蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理下,几乎无法检测到SmbHLH128蛋白条带。SmMYB36的CHX处理组蛋白含量在三组处理组中是最少的,CHX与MG132的共同处理组蛋白含量居三个处理组的中间,MG132处理组蛋白含量则是最高的。以上结果表明SmMYB36及SmbHLH128蛋白是不稳定的,且其降解是通过26S蛋白酶体途径来完成的。2、对SmbHLH128过表达转基因拟南芥进行处理,发现MG132处理使SmbHLH128蛋白的积累量明显升高,再次证明转录因子SmbHLH128蛋白不稳定,且通过26S蛋白酶体途径进行降解。3、利用Cell free体外降解体系验证His-SmMYB36及His-SmbHLH128原核表达重组蛋白的稳定性及降解途径,结果显示两重组蛋白均会在一定时间内迅速降解,且MG132的加入显著延迟蛋白的降解速度。表明His-SmMYB36及His-SmbHLH128重组蛋白的降解都依赖于植物体内的26S蛋白酶体系统完成,抑制26S蛋白酶体系统的工作可以阻碍SmMYB36及SmbHLH128蛋白的降解。4、利用丹参全基因组数据库预测丹参中的E3泛素连接酶Sm COP1/SPA(constitutively photomorphogenic1/suppressor of phy A-105),对其编码的蛋白进行理化性质分析,并在此基础上克隆得到了丹参Sm COP1/SPA基因家族中的一个E3泛素连接酶Sm COP1a。酵母双杂交实验表明,SmbHLH128与Sm COP1a不互作,而SmbHLH128与泛素互作。推测Sm COP1a并不是介导SmbHLH128蛋白泛素化的E3连接酶,SmbHLH128的泛素化修饰过程依然依赖于其他E3连接酶,或是COP1-SPA复合体等的共同参与。