研究背景与目的胰腺癌(Pancreatic cancer,PC),是发生在胰腺的恶性肿瘤。是我们肝胆外科的常见肿瘤。由于早期的胰腺癌没有明显症状,通常确诊的病人都是晚期患者。大约90%的患者就诊时,已经无法进行根治性的手术治疗。统筹整个患者群体,五年生存率低于5%。大部分患者只能选择化疗作为治疗手段。传统的化学药物对于胰腺癌的控制几乎没有什么作用。过去常用药物5-氟尿嘧啶(5‘-Fluorouracil,5-FU),对胰腺癌的反应率也很少超过25%。现在,胰腺癌的第一线标准治疗仍然是单一使用吉西他滨来化疗,其剂量建议1000 mg/m2。但吉西他滨的反应率并不突出,也不能完全治愈胰腺癌,吉西他滨的影响有限,只能稍微提升生活品质,它对正常细胞毒性较小,能够减轻疼痛,稍稍延长患者生命。目前,对胰腺癌没有非常有效的抗癌药品可供选择,吉西他滨在1998年被美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)核准为用于治疗胰腺癌的第一个化疗药品。2005年11月,美国食品药物管理局核准了靶向治疗药物埃罗替尼(Erlotinib,即特罗凯)可联合吉西他滨合使用,作为胰腺癌的一线化疗手段。联合使用在存活期及反应率比较上有统计学意义,但是临床治疗上并不能发现其带来的明显好处。顺铂(cisplatin,CDDP)是经典的化疗药物,因为胰腺癌很容易发生顺铂耐药,故没有用在胰腺癌化疗上。而胰腺癌顺铂耐药机制,目前尚不清楚。上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是细胞由原来的上皮形态,通过一些反应,向间充质形态转化,获得间充质细胞表型的过程。最近越来越多的文献报道显示,激活EMT会使大部分上皮来源的中路细胞获得间质表型。EMT过程与肿瘤细胞的远处转移,复发,肿瘤细胞侵袭转移力增加密切相关。还有证据显示,激发EMT过程与肿瘤的化疗耐药密切相关。在肿瘤细胞中,EMT的激发依赖多种信号传导途径的调控。在胰腺癌中,Zeb-1和其他EMT的调控子可能维持了胰腺癌的化疗耐药状态,这说明在胰腺癌中,EMT与化疗耐药密切相关。因此研究EMT关键分子的调控机制、研究胰腺癌细胞的耐药机理,发展有效的治疗措施措施、探索潜在的治疗靶点,逆转耐药机制,有重要意义。前列腺凋亡反应蛋白-4(Prostate apoptosis response-4,Par-4),最早被发现在前列腺癌细胞中,是一个促凋亡反应蛋白。它是PAR4基因的表达产物。Par-4蛋白具有独特的促肿瘤细胞凋亡,却不影响正常细胞的作用,这使得Par-4蛋白的安全性非常高。再者,Par-4蛋白可以从内源性和外源性两种途径诱导肿瘤细胞的凋亡,这让它的抗肿瘤能力成倍上升。Par-4在一系列的人类癌症组织中都被发现下调包括胰腺癌,它的下调被认为是肿瘤发生的关键事件之一,而且在胰腺癌的细胞中,Par-4蛋白的低表达预示着非常差的预后。Par-4蛋白仅凭自身就可诱导肿瘤细胞的凋亡反应,而且还可通过增加肿瘤细胞对凋亡介质的敏感性,如阿霉素、TNF-α(tumor necrosis factor-α),TNF相关的凋亡反应配体,来触发肿瘤细胞凋亡反应。研究还显示,结肠癌细胞对5-FU的敏感性可被Par-4增加。特别是在胰腺癌细胞中,Par-4在调节Bcl-2家族蛋白的小分子阻断剂导致的胰腺癌细胞凋亡事件中,扮演着调节敏感性的重要角色。近年来,Par-4已经被作为一个非常重要的靶向治疗的位点,许多临床试验也已经开展。但是,Par-4的下调是否与胰腺癌的顺铂耐药有关,到底怎样参与了耐药过程,还没有相关研究。我们猜测耐顺铂的胰腺癌细胞中发生了EMT,Par-4蛋白水平更低。下面来探讨CDDP耐药的胰腺癌细胞的作用机制。材料方法及结果1、以CDDP诱导建立胰腺癌耐药细胞株BXPC-3/CDDP。以西南医院肝胆实验室的BXPC-3细胞为亲本细胞,培养液中CDDP浓度从0.1μg/ml开始,浓度逐渐升至1μg/ml。建成BXPC-3/CDDP耐药细胞株。与BXPC-3细胞相比,BXPC-3/CDDP细胞更为细长,细胞较分散,呈间充质细胞样形态改变。MTT实验检测细胞耐药性。结果显示BXPC-3/CDDP细胞较其亲本细胞BXPC-3明显耐药。BXPC-3的耐顺铂细胞株BXPC-3/CDDP建立成功。以上结果说明用成功用CDDP浓度梯度法诱导BXPC-3变为BXPC-3/CDDP。2、探索耐药细胞株BXPC-3/CDDP与EMT的关联。用western blot检测BXPC-3和BXPC-3/CDDP中EMT标志物:snail,twist,E-cadherin,N-cadherin,并作出比较。细胞Transwell侵袭实验评价其与亲本细胞侵袭转移能力。结果显示,相比BXPC-3细胞,BXPC-3/CDDP细胞中snail表达水平上升,twist1表达水平上升,E-cadherin水平下降,N-cadherin水平上升。Transwell实验显示:BXPC-3/CDDP较其亲本细胞BXPC-3侵袭力上升。在BXPC-3/CDDP中,较其亲本细胞BXPC-3,发生了EMT。以上结果说明:BXPC-3/CDDP,较其亲本细胞BXPC-3,发生了EMT改变。3、探索耐药细胞株BXPC-3/CDDP中Par-4在mRNA和蛋白水平表达的情况。Western blot检测耐药细胞株BXPC-3/CDDP中Par-4蛋白表达水平,RT-PCR检测耐药细胞株BXPC-3/CDDP中Par-4 mRNA水平。以上结果显示,较BXPC-3,BXPC-3/CDDP中Par-4在蛋白和mRNA水平均降低了。4、Par-4的过表达与BXPC-3/CDDP细胞的顺铂耐药性、EMT有关。5、在BXPC-3/CDDP中采用过表达Par-4策略,用慢病毒包装转染pcDNA3.1-Par-4后,EMT相关标志物E-cadherin,N-cadherin用western blot检测。肿瘤细胞Transwell侵袭试验用来检测其转染后与未转染的侵袭力对比。MTT试验检测耐药性。结果显示,在BXPC-3/CDDP中过表达Par-4后,E-cadherin水平上升,N-cadherin水平下降。细胞侵袭转移水平下降,耐药性降低。呈MET改变。以上结果显示在BXPC-3/CDDP中从基因层面上调PAR4,会使肿瘤细胞发生MET改变,耐药能力下降。6、干扰BXPC-3中PAR-4基因后,细胞上皮表型发生改变。在BXPC-3中采用RNA干扰策略,降低Par-4表达。转染Par-4 SiRNA(small interfering RNA,小干扰RNA)后,western blot检测EMT相关标志物E-cadherin,N-cadherin。肿瘤细胞Transwell侵袭试验用来检测干扰前后侵袭力对比。用MTT试验来检测干扰前后细胞耐药性。结果显示,在BXPC-3中敲除Par-4后,E-cadherin水平下降,N-cadherin水平上升。细胞侵袭转移水平上升,耐药性增高。呈EMT改变。以上结果证明从基因层面下调BXPC-3中PAR-4基因后,肿瘤细胞发生了EMT趋势,耐药性增加,侵袭转移能力增强。7、BXPC-3中PAR-4基因下调后,细胞发生的EMT与PI3K/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase,磷脂酰肌醇3激酶)信号通路有关。在BXPC-3中采用RNA干扰策略。转染Par-4 Si RNA后,加入PI3K/Akt阻断剂LY294002来阻断该信号通路。EMT相关标志物E-cadherin,N-cadherin用western blot来检测。肿瘤细胞Transwell侵袭试验用来检测加阻断剂前后侵袭力对比。用MTT试验来检测加阻断剂前后肿瘤细胞耐药性。结果显示,在BXPC-3中敲除Par-4,加入PI3K/Akt阻断剂LY294002后,E-cadherin水平较未加阻断剂组上升,N-cadherin水平较未加阻断剂组下降。细胞侵袭转移水平较未加阻断剂组下降,耐药性降低。EMT改变被阻断。另一试验证实,BXPC-3转染Par-4 siRNA后随时间推移测western测p Akt/total Akt比值,呈逐渐上升趋势。以上结果表明基因层面PAR4的下调通过PI3K/Akt途径激活了EMT,导致了BXPC-3细胞顺铂耐药。8、肿瘤细胞裸鼠移植瘤实验。接种肿瘤细胞后,用顺铂腹腔注射治疗,测各组肿瘤体积变化与70天生存率。结果示:顺铂对Par-4 siRNA-transfected BXPC-3组几乎没有作用,但加入PI3K/Akt阻滞剂LY294002后,该组的顺铂耐药被逆转。以上解说表明,在体外实验中,阻断PI3K/Akt途径可以逆转Par-4下调引起的EMT介导的耐药。研究结论本研究明确了耐顺铂的胰腺癌细胞BXPC-3/CDDP中,肿瘤细胞发生了EMT改变。同时,其Par-4在蛋白和mRNA水平都被发现下降。在基因层面上调耐药细胞株BXPC-3/CDDP的PAR-4水平,可以逆转顺铂耐药,通过MET(mesenchymal epithelial transition)途径。