杂色鲍在不同外界因子胁迫下HIF信号通路相关基因的研究

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近些年,全球气候的变暖已经对自然和社会环境产生了深远的影响。在海洋生态系统中,水温的升高可能会导致一系列的负面影响,如微生物的大量繁殖和溶解氧的降低。这些环境因素的改变最终将导致水生生物暴露于缺氧的环境中。一般情况下,外界环境的改变往往会诱发机体内一系列的生理生化的变化来适应这一改变。而这一适应的过程,在很大程度上都依赖于编码这些理化反应相关蛋白基因的表达水平的改变。缺氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor1,HIF-1)包括α和β两个亚基,是缺氧环境下的一个主要的转录因子,可以通过对不同基因表达水平的调节来适应缺氧的环境。本研究首次对杂色鲍(Haliotis diversicolor)的HIF-1α、HIF-1β和硒结合蛋白1(Selenium-binding protein1, SBP1)基因进行了报道,并分别将杂色鲍的HIF-1α、HIF-1β和SBP1基因命名为HdHIF-1α、HdHIF-1β和HdSBP1。同时,采用生物信息学的方法分析了杂色鲍的HdHIF-1α、HdHIF-1β和HdSBP1基因的特征。另外,我们还利用实时定量PCR和RNA干扰等技术分析了HIF信号通路相关基因在杂色鲍缺氧、高温、缺氧&高温联合应激以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后不同时间点的表达情况。主要的研究结果如下:  (1)获得了杂色鲍HdHIF-1α、HdHIF-1β和HdSBP1的全长cDNA序列,长度分别为2833 bp、1919 bp和2269 bp并分别编码了711个氨基酸、590个氨基酸和497个氨基酸。与其它物种的 HIF-1相似,杂色鲍 HdHIF-1也具有一个碱性螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)和两个 PAS(PERARNT-SIM)结构域。其中 HdHIF-1α还有一个氧依赖的降解结构域(oxygen-dependent degradation domain,ODDD)和一个转录激活结构域(C-terminal activation domain, C-TAD)。同时,我们还使用生物信息学方法对HIF-1α、HIF-1β和SBP1基因进行了基因同线性分析。  (2)在鳃组织中,HdHIF-1α基因在杂色鲍经不同外界因子胁迫下各时相的qRT-PCR结果显示:缺氧处理之后,HdHIF-1α的表达量在处理4 h、24 h和96 h后实验组显著性高于对照组(P<0.05);高温应激之后,实验组HdHIF-1α基因的表达量在第三时相(31℃4 h)显著性高于对照组(P<0.05)。缺氧&高温联合应激之后,HdHIF-1α的表达量在0 h、4 h和24 h实验组显著性高于对照组(P<0.05);副溶血弧菌注射感染之后,3 h和12 h实验组显著性高于对照组( P<0.05)。在血细胞中, HdHIF-1α基因在杂色鲍缺氧应激后, HdHIF-1α的表达量在处理24 h和96 h后的实验组显著高于对照组(P<0.05);高温应激后, HdHIF-1α的表达量在第2和3时相实验组显著高于对照组(P<0.05);缺氧&高温联合应激后,HdHIF-1α的表达量在24 h和96 h实验组显著高于对照组(P<0.05);副溶血弧菌注射感染之后,HdHIF-1α基因的表达量在每个时相的实验组都显著高于对照组(P<0.05)。  (3)HdHIF-1β基因在杂色鲍鳃组织和血细胞中,每个应激之后各时相的qRT-PCR结果显示:HdHIF-1β的表达量在处理组,实验组和对照组表达量无显著差异。  (4)HdSBP1基因在杂色鲍经不同外界因子胁迫下各时相的 qRT-PCR结果显示:缺氧处理之后,实验组HdSBP1在鳃组织和血细胞的表达量分别在处理24 h和192 h后显著高于对照组(P<0.05);高温应激之后,在鳃组织中,实验组HdSBP1的表达量在第1时相(28℃)与第3时相(31℃4 h)显著高于对照组(P<0.05),而在血细胞中只有在第3时相实验组与对照组存在显著性差异;缺氧&高温联合应激之后,在鳃组织中 HdSBP1的表达量在192 h实验组显著高于对照组(P<0.05),在血细胞中HdSBP1的表达量在0 h、4 h和24 h时实验组显著高于对照组(P<0.05);副溶血弧菌注射感染之后,在鳃组织中HdSBP1的表达量在6 h和24 h实验组显著性高于对照组(P<0.05),而血细胞中HdSBP1基因的表达量在每个时相的实验组都显著高于对照组(P<0.05)。  (5)在不同刺激处理下的杂色鲍鳃组织和血细胞中,一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,HdNOS)与肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factorα, HdTNF-α)基因在各时相的表达都有不同程度上的显著变化(P<0.05)。  (6)RNA干扰抑制HdHIF-1α后,培养的血细胞中HdHIF-1α基因的表达水平显著下调(P<0.05)。同时,也检测了 HdHIF-1α受抑制后,HdHIF-1α若干靶基因的表达情况,如:HdTNFα、细胞凋亡蛋白酶(Caspase3,HdCasp3)、乳糖脱氢酶D(D-lactate dehydrogenase, HdLDHD)、己糖激酶(Hexokinase,HdHK)和磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase,HdGAPDH),结果显示:它们的表达量与绿色荧光蛋白和空白对照组相比显著性下调(P<0.05)。
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