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干燥综合征(sjogrens syndrome，SS)是以口眼干燥、泪液唾液分泌减少，可累及多脏器为临床表现，以淋巴细胞高度浸润为病理特点的弥漫性结缔组织病，分为原发性和继发性。原发性干燥综合征(primary sjogrenssyndrome PSS)从发病到病变迁延的基础是免疫功能紊乱，外分泌腺管道上皮细胞可发挥抗原递呈作用，细胞识别抗原后T、B细胞增殖，促使B细胞分化为浆细胞，进而产生大量免疫球蛋白、自身抗体，导致体液免疫过度的异常反应，聚集大量的各种细胞因子和炎症介质造成组织损伤。 在此过程中有一类CD4+T细胞亚群，辅助B细胞，以趋化因子受体CXCR5为主要表面标志物，高表达特异性ICOS、BCL-6、CD40、PD-1，分泌IL-21发挥其生物学功能，起着不可或缺的作用，这类细胞称为滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell，Tfh cell)。 目的:目前，国内外对Tfh细胞在SS中致病作用研究仍不是很全面，本文主要是通过流式细胞术(flow cytometry FCM)检测外周血CD4+CXCR5+T细胞表达率，实时定量PCR(RT-PCR)检测外周血CXCR5、ICOS mRNA的表达量，免疫组织化学方法(Immunohistochemical IHC)检测唇腺组织中ICOS、Bcl-6蛋白的表达情况及定位，探讨Tfh细胞在干燥综合征发病过程中其数量及生物学功能发生异常的表现。 方法: 1、选取河北医科大学第二医院免疫风湿科2014年1月至2015年1月PSS患者30例作为PSS组，男性2例，女性28例，年龄范围40～65岁之间，平均年龄(50.47±9.96)岁，其中无系统损害患者20例，伴肺间质纤维化患者2例，肺动脉高压患者1例，免疫性血小板减少患者5例，肾小管酸中毒患者2例，入组前均未应用激素、免疫抑制剂等药物治疗。 1.1流式细胞分析(FCM):30例PSS患者作为PSS组，20例健康志愿者作为健康对照组，晨起空腹采外周静脉血1ml，肝素钠抗凝，采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+T细胞百分率，比较两组间的差异及与临床指标的相关性。 1.2实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR):30例PSS患者作为PSS组，20例健康志愿者作为健康对照组，晨起空腹采外周静脉血5ml，EDTA抗凝的，用Real Time PCR方法检测PSS组和健康对照组外周血CXCR5mRNA、ICOS mRNA表达量的变化情况。通过引物设计、提取样本总RNA、逆转录合成cDNA，RT-PCR反应体系的建立，获得各样本实时扩增曲线图和样本扩增产物溶解曲线图，计算出各样本基因相对定量分析结果。 1.3免疫组织化学法(IHC):PSS患者唇腺组织为研究标本，共30例，同时选取下唇外伤、粘膜下囊肿等非自身免疫性疾病患者20例作为对照组，所有研究对象的唇腺腺泡组织标本均由4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，免疫组织化学方法检测标本中ICOS、Bcl-6蛋白的表达及定位，以淋巴细胞浸润不同等级为观察基石，显微镜下观察两组间、等级间ICOS、Bcl-6蛋白的表达、定位的差异，与淋巴细胞、浆细胞及正常唇腺组织间的相关性，以及与生发中心的形成可能存在的联系。 2、临床指标归纳:回顾并总结PSS患者临床指标，包括免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、血沉(ESR)、抗SSA/SSB抗体等，并与本实验所检测指标进行相关性分析。 3统计学分析:采用SPSS21.0版统计软件进行统计分析，一般数据资料以((x)±s)表示;两个独立样本比较服从正态分布，采用t检验，不服从正态分布采用秩和检验（U检验）;多个独立样本比较服从正态分布采用方差分析，不服从正态分布采用秩和检验（H检验），计数资料比较采用卡方检验。两变量间的相关性分析，如服从正态分布采用pearson相关系数，不服从正态分布采用spearman相关系数。以检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1、FCM:PSS患者外周血中CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T细胞百分率显著高于正常对照组，且有统计学意义(16.84±6.38 vs12.85±2.38，P=0.001)。PSS组外周血中CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T细胞百分率与临床指标血沉(ESR)、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均无相关性(r=-0.096，P=0.614),(r=-0.280,P=0.133),(r=-0.276,P=0.139),(r=-0.287,P=0.123)。抗SSA、抗SSB抗体阳性组与阴性组之间无统计学差异(Z=-0.915，P=0.360),(Z=-1.011, P=0.312)。 2、RT-PCR: PSS组外周血CXCR5 mRNA表达明显高于健康对照组，且有统计学意义(1.37±0.69 vs0.57±0.12，P=0.000)。PSS组外周血ICOSmRNA表达水平与健康对照组相比上调(1.97±0.73 vs1.54±0.58，P=0.036)。PSS组外周血中CXCR5 mRNA表达高低与临床指标血沉ESR、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均无相关性(r=-0.065，P=0.733)，(r=-0.051，P=0.788),(r=-0.177,P=0.350),(r=-0.259,P=0.167)。与抗SSA/SSB抗体阳性组与阴性组之间无差异(Z=0.000，P=1.000)，(Z=-1.571，P=0.116); PSS组外周血中ICOS mRNA表达高低与临床指标血沉ESR、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均无相关性(r=0.024，P=0.898)，(r=-0.166，P=0.382)，(r=-0.266，P=0.156)，(r=-0.394，P=0.031)，与抗SSA/SSB抗体阳性组与阴性组之间无差异(Z=-0.665，P=0.506)，(Z=-1.442，P=0.149)。 3、IHC: HE染色，显微镜下观察PSS组和对照组唇腺组织结构，对照组:腺泡大小分布均匀，导管排列整齐，间质无或少量炎性细胞浸润;PSS组:腺泡大小分布不等，可见部分腺体萎缩，以导管周围为明显，间质散在分布或一个多个灶性淋巴细胞浸润;免疫组化，PSS组与对照组ICOS蛋白表达水平评分分别为3.5(2，6)分，1(0，1)分，二者差异的比较有统计学意义(Z=-5.54，P=0.000); PSS组组织切片中导管细胞及其周围淋巴细胞均可检测到ICOS蛋白的表达，腺泡细胞偶可检测到阳性细胞。经统计学分析ICOS蛋白表达与导管周围淋巴细胞浸润程度呈显著正相关(P=0.020)，说明ICOS蛋白与淋巴细胞浸润程度有关;PSS组与对照组Bcl-6蛋白表达水平评分分别为6(2，6)分、0(0，1)分，二者差异的比较有统计学意义(Z=-5.70，P=0.000); PSS组组织切片中导管细胞及其周围淋巴细胞均可检测到Bcl-6蛋白的表达，腺泡细胞偶可检测到阳性细胞。经统计学分析Bcl-6蛋白表达与导管周围淋巴细胞浸润程度呈显著正相关(P=0.001)，说明Bcl-6蛋白与淋巴细胞浸润程度有关。 4、相关性分析:PSS组外周血CD4+CXCR5+T细胞的表达与外周血CXCR5 mRNA、ICOS mRNA表达水平均存在正相关性(r=0.635，P=0.000)，(r=0.708，P=0.000); PSS组外周血CD4+CXCR5+T细胞的表达与唇腺组织中ICOS蛋白、Bcl-6蛋白表达水平均无相关性(r=0.031，P=0.871)，(r=0.006，P=0.976); PSS组外周血CXCR5 mRNA与ICOS mRNA表达水平有相关性(r=0.665，P=0.000); PSS组外周血ICOS mRNA表达水平与唇腺组织中ICOS蛋白表达水平无相关性(r=-0.044，P=0.817);疾病组唇腺组织中ICOS蛋白与Bcl-6蛋白表达水平呈正相关性(r=0.594，P=0.001)。 结论: 1、PSS患者外周血CD4+CXCR5+Tfh样细胞占CD4+T细胞的比例明显升高，提示Tfh细胞可能对PSS疾病的发生发展起促进作用。 2、PSS患者外周血CXCR5、ICOS基因的表达量较健康对照组升高，且二者呈正相关性，Tfh细胞可能通过表达ICOS基因发挥其生物学作用。 3、PSS患者唇腺组织中ICOS、Bcl-6的表达增高，与唇腺组织中淋巴细胞的浸润程度有关，说明Tfh细胞可能在PSS患者涎腺组织损伤中起促进作用，但与外周血Tfh细胞表达相关性有待进一步研究。