论文部分内容阅读
细菌耐药性是全球性的公共卫生问题,食品动物中抗菌药物的广泛应用,特别是不合理使用更是促进了细菌耐药性发生、发展。建立快速药敏试验（antimicrobial susceptibility testing,AST）能够帮助兽医在更短时间内选出合适的抗菌药物,从而减少抗菌药物使用的盲目性。近年来,快速药敏试验技术尽管取得了一定的发展,但在成本效益、准确性、技术与操作难度等方面存在着不足之处。本研究基于细菌在抗菌药物作用下对培养基碳、氮源消耗情况建立了快速药敏试验。1.常见病原菌的传统药敏试验为下一步快速药敏试验的建立与应用提供数据比对,利用微量肉汤稀释法,检测细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌各30株）对抗菌药物（头孢曲松钠、阿莫西林-克拉维酸钾、环丙沙星、四环素、庆大霉素）的敏感与耐药情况。结果显示,耐药菌占比为78.00%（351/450）,敏感菌占比为22.00%（99/450）。2.基于培养基碳源的快速药敏试验方法建立与应用首先,为筛选合适的细菌浓度与孵育时间,将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌（7.5×10~5、7.5×10~6、7.5×10~7CFU/m L）分别与环丙沙星（浓度为美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）敏感折点）共孵育3、4、5、6h后,利用葡萄糖氧化酶法进行显色反应,检测OD490nm以反映细菌对培养基碳源的消耗情况。结果显示,当细菌浓度为7.5×10~6CFU/m L,孵育时间为5 h时,可区敏感菌株与耐药菌株,并与微量肉汤稀释法的符合率为100%（6/6）。其次,将上述筛选的优化条件用于更多的菌株和抗菌药物（头孢曲松钠、阿莫西林-克拉维酸钾、环丙沙星、四环素、庆大霉素,浓度为CLSI MIC敏感折点）,将检测结果OD490nm与微量肉汤稀释法的结果一一对应,进行显著性检验。以OD490nm为检验变量,微量肉汤稀释法为状态变量,进行受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析。结果显示,经微量肉汤稀释法鉴定的敏感菌样本（n=98）的OD490nm（1.112±0.035）极显著（P＜0.001）高于耐药菌样本（n=202）的OD490nm（0.1879±0.012）。ROC曲线分析表明,当OD490nm临界值为0.3705时,基于培养基碳源的快速药敏试验方法的灵敏度为93.90%,特异性为95.00%,约登指数为0.889。重复性试验表明,组内变异系数为1.13%～3.73%,组间变异系数为1.57%～9.44%,均小于10%。第三,为考察新建立的方法的准确性,用建立的新方法检测常见动物源细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌各10株）和常用抗菌药物（头孢曲松钠等5种）。结果显示,该方法与微量肉汤稀释法的符合率为93.33%（140/150）,且检测时间缩短至6 h。3.基于培养基氮源的快速药敏试验方法建立与应用首先,为筛选合适的细菌浓度与孵育时间,将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌（7.5×10~5、7.5×10~6、7.5×10~7CFU/m L）分别与环丙沙星（浓度为CLSI MIC敏感折点）共孵育4、5、6、7 h后,利用茚三酮比色法进行显色反应,检测OD570nm以反映细菌对培养基氮源的消耗情况。结果显示,当细菌浓度为7.5×10~6CFU/m L,孵育时间为6 h时,可区分敏感菌株与耐药菌株,并与微量肉汤稀释法的符合率为100%（6/6）其次,将上述筛选的优化条件用于更多的菌株和抗菌药物（头孢曲松钠、阿莫西林-克拉维酸钾、环丙沙星、四环素、庆大霉素,浓度为CLSI MIC敏感折点）,将检测结果OD570nm与微量肉汤稀释法的结果一一对应,进行显著性检验。以OD570nm为检验变量,微量肉汤稀释法为状态变量,进行ROC曲线分析。结果显示,经微量肉汤稀释法鉴定的敏感菌样本（n=98）的OD570nm（1.216±0.023）极显著（P＜0.001）高于耐药菌样本（n=202）的OD570nm（0.5112±0.016）。ROC曲线分析表明,当OD570nm临界值为0.7495时,基于培养基氮源的快速药敏试验方法的灵敏度为94.90%,特异性为91.10%,约登指数为0.860。重复性试验表明,组内变异系数为1.03%～6.50%,组间变异系数为4.19%～9.59%,均小于10%。第三,为考察新建立的方法的准确性,用建立的新方法检测常见动物源细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌各10株）和常用抗菌药物（头孢曲松钠等5种）。结果显示,该方法与微量肉汤稀释法的符合率为94.67%（142/150）,且检测时间缩短至7 h。综上所述,本研究建立了基于培养基碳、氮源建立的快速药敏试验（以葡萄糖、氨氮为例）,具有灵敏度和特异性高、检测时间短、重复性好、成本低、操作简易等优点,初步认为可应用于常见动物源细菌和常用抗菌药物的快速药敏试验。